| 應用領域 | 生物產業 |
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isoCell是英國iotaSciences公司推出的一款基于GRID專利技術（專利號：WO2019197373A1）的高通量、高自動化的單細胞可視化分選培養系統。isoCell采用微射流技術，利用界面張力對細胞培養基（或干細胞涂層）進行重塑，在培養皿上雕刻出單獨的細胞腔室GRID（可以在6厘米培養皿上創建256個單細胞腔室陣列），并將細胞自動地分配到各個單細胞腔室中。
相比于傳統方法的低效與高消耗，isoCell僅需極少量的培養基與試劑，自動將細胞分選至腔室，通過自帶的光學顯微鏡可以清楚地看到腔室中的細胞，以確保分選出的細胞100%為單細胞。isoCell可將單細胞在GRID中培養成單克隆細胞系，培養過程中可以根據客戶需求進行換液操作，全流程可視化監控以確保每個單細胞克隆均來自所挑選的單個細胞，培養完成后可自動收獲單克隆細胞系。
通過isoCell單細胞可視化分選培養系統可以實現高通量、自動化、高效率的細胞系構建、CRISPR-Cas9基因編輯等功能。
設備特點
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自動化的單細胞分選，培養至細胞克隆并收獲
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自動化的單細胞識別及全腔室圖像記錄
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操作條件溫和，有效維持細胞活性，確保細胞克隆高存活率
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全觸屏控制，系統引導完成整個工作流程
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自動轉移至PCR管或96孔板
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自動生成每個細胞克隆的克隆性報告
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兼容多種試劑
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主要應用
細胞系構建
單細胞克隆是開發穩定細胞系的關鍵步驟，這一過程需要進行詳盡的記錄和驗證，以確保最終細胞系的身份、穩定性及一致性。通過質粒轉染宿主細胞，建立轉染細胞池后，分離單細胞并將其培養成克隆群體至關重要。isoCell的特有的單細胞培養腔室便于進行可靠的單克隆性驗證，包括全腔室圖像及相關記錄。所有繁瑣的移液操作均自動化進行，簡化了流程并確保了過程的一致性。建立的單克隆細胞系將經過后續多種測試，評估其生長特性和目標產物的生產能力。
CRISPR-Cas9基因編輯
在建立基因編輯細胞的過程中，單細胞克隆是整個工作流程中最大的挑戰。CRISPR-Cas9編輯細胞池建立后，分離單細胞并將其培養成克隆群體至關重要。初始細胞池中同時包含編輯和非編輯細胞，因此分離步驟必不可少。傳統的手動單細胞克隆方法繁瑣且難以確保單克隆性，isoCell的單細胞培養腔室能夠輕松可靠地驗證單克隆性，解決了上述問題，同時將所有移液操作自動化，簡化了流程并確保了一致性。
應用案例
人誘導多能干細胞（hiPSCs）敲除/單核苷酸多態性（SNP）敲入的優化CRISPR實驗方案
本文提出了一種優化CRISPR-Cas9方案，用于在人類誘導多能干細胞（hiPSCs）中高效實現基因敲除（KO）或單核苷酸多態性（SNP）敲入（KI）。該流程整合了基因組靶向設計、CRISPR遞送、編輯效率評估和自動化單細胞克隆分離技術，顯著提高了基因編輯的成功率和克隆存活率。研究人員采用isoCell自動化平臺進行單細胞克隆分離，顯著提升了克隆篩選的效率和準確性。
完成轉染的hiPSCs經過編輯效率驗證后，使用isoCell進行單細胞克隆分選。以下步驟描述的是針對一個細胞克隆GRID（包含256個獨立腔室）的接種過程，預期細胞克隆存活率不低于40%。
采用isoCell優化的細胞克隆方法，在256個腔室的GRID中，接種當天可計數到平均70個含有單細胞的小室（圖A），其中平均有46個克隆存活，存活率可達65%。對于22種不同的iPSC細胞系的32個基因位點的KO score和KI score評分，最低的評分分別為15和10（圖B）。但由于相對較高的克隆效率，一塊GRID也能夠獲得多達5個克隆。
參考文獻：
Ludwik, K. A., Telugu, N., Schommer, S., Stachelscheid, H., & Diecke, S. (2023). ASSURED-optimized CRISPR protocol for knockout/SNP knockin in hiPSCs. STAR protocols, 4(3), 102406.
《Cell》膠質母細胞瘤（GBM）通過表觀遺傳免疫編輯獲得骨髓相關轉錄程序以引發免疫逃逸
膠質母細胞瘤（GBM）在基因組、轉錄組和表觀遺傳層面上表現出高度的腫瘤內和腫瘤間異質性。GBM與腫瘤免疫微環境之間的相互作用在腫瘤的發生和發展中起著重要作用。然而，GBM如何促進腫瘤免疫微環境的機制仍然不清楚。英國愛丁堡大學再生醫學中心的Steven M. Pollard團隊[1]通過體外試驗和動物模型發現，膠質母細胞瘤干細胞（glioblastoma stem cell, GSC）通過表觀遺傳途徑進行免疫編輯，促進髓系細胞的招募，形成富含髓系細胞的腫瘤微環境，從而實現免疫逃逸并促進腫瘤進展。
本文中研究者使用iotaSciences的單細胞可視化分選培養系統isoCell分選并培養了NPE-IE Irf8敲除細胞，隨后構建了相應的細胞系。NPE-IE Irf8敲除細胞系的腫瘤發展動力學與移植了NPE-IE細胞的小鼠相似，證明Irf8的激活是NPE-IE細胞免疫逃逸的重要因素，并且這種激活可能通過體內的IFNγ信號介導。
這項研究揭示了GBM細胞在受到免疫攻擊后，通過表觀遺傳重組和髓系特異性轉錄因子的表達，增強TME的免疫抑制性，促進腫瘤細胞的免疫逃逸。這為監測免疫治療過程中GBM細胞的免疫逃逸及制定新的免疫治療策略提供了新的思路，對于在GBM中發現的表觀遺傳免疫編輯過程是否也適用于其他腦瘤或癌癥，將具有重要意義。
參考文獻：
[1]. Gangoso, E., Southgate, B., Bradley, L., Rus, S., Galvez-Cancino, F., McGivern, N., ... & Pollard, S. M. (2021). Glioblastomas acquire myeloid-affiliated transcriptional programs via epigenetic immunoediting to elicit immune evasion. Cell, 184(9), 2454-2470.
測試數據
人類誘導多能干細胞(hiPSCs)的單細胞克隆
人類誘導多能干細胞(hiPSCs)構建單克隆細胞系培養步驟繁瑣，細胞對異常的處理和操作非常敏感，傳統單細胞分選容易導致細胞和遺傳毒性應激的積累，進而導致不良分化和多能性喪失。使用isoCell可以溫和且自動化地將人類誘導多能干細胞(hiPSCs)進行單細胞分選，并高效地培養hiPSCs單克隆細胞系，顯著提高了細胞分離與克隆效率（如下圖所示）。
HEK293單克隆細胞培養
對人類誘導多能干細胞 (hiPSCs) Prime 編輯構建工程細胞系
Prime 編輯可在 HEK3 基因座中高效精確插入三個核苷酸，用于構建工程細胞系hiPSCs。通過引入靶標特異性 pegRNA 來編輯單個或多個基因組位點，以進行精確有效的基因組編輯，促進疾病建模和功能遺傳學研究。
Prime 編輯使用與逆轉錄酶融合的 Cas9 切口酶，將 DNA 序列從“Prime 編輯”引導 RNA (pegRNA) 復制到特定基因座。通過Prime 編輯將多西環素誘導型 Prime Editor 蛋白 (PE2) 整合到 iPSC 細胞系的AAVS1 基因組，之后使用isoCell分選轉入靶基因的hiPSCs細胞系，以確保細胞的單克隆性。（見上圖）
該研究使用isoCell來確保工程細胞系的單克隆性與準確性。
參考文獻：
Bharucha N, Ataam J A, Gavidia A A, et al. Generation of AAVS1 integrated doxycycline-inducible CRISPR-Prime Editor human induced pluripotent stem cell line[J]. Stem Cell Research, 2021, 57: 102610.
發表文章
1. Fahy, K., Kapishnikov, S., Donnellan, M., McEnroe, T., O'Reilly, F., Fyans, W., & Sheridan, P. (2024). Laboratory based correlative cryo-soft X-ray tomography and cryo-fluorescence microscopy. Correlative Light and Electron Microscopy V, 293.
2. Fahy, K., Weinhardt, V., Vihinen-Ranta, M., Fletcher, N., Skoko, D., Pereiro, E., ... & McEnroe, T. (2021). Compact Cell Imaging Device (CoCID) provides insights into the cellular origins of viral infections. JPhys Photonics, 3(3).
3. Kapishnikov, S., Hempelmann, E., Elbaum, M., Als‐Nielsen, J., & Leiserowitz, L. (2021). Malaria pigment crystals: The achilles′ heel of the malaria parasite. ChemMedChem, 16(10), 1515-1532.
4. Kapishnikov, S., Staalsø, T., Yang, Y., Lee, J., Perez-Berna, A. J., Pereiro, E., ... & Als-Nielsen, J. (2019). Mode of action of quinoline antimalarial drugs in red blood cells infected by Plasmodium falciparum revealed in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences, 116(46), 22946-22952.
5. Kapishnikov, S., Leiserowitz, L., Yang, Y., Cloetens, P., Pereiro, E., Awamu Ndonglack, F., ... & Als-Nielsen, J. (2017). Biochemistry of malaria parasite infected red blood cells by X-ray microscopy. Scientific reports, 7(1), 802.
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