MagCapture™外泌體提取試劑盒PS-WAKO

MagCapture™外泌體提取試劑盒PS-WAKO

細胞外囊泡 (EV) 在各種生物學功能中發揮重要作用，包括腫瘤發展、神經變性和免疫調節等。因此，研究人員越來越關注開發靶向或應用EV的療法。并且有新研究指出可以通過操縱產生EV的細胞來設計分子的表達，從而增強EV療法靶向細胞的響應。

在本次網絡研討會中，金澤大學的華山教授將介紹他關于開發調節抗腫瘤免疫和不同免疫響應的設計細胞外囊泡（designer EVs）的最新研究，并討論其應用于臨床的可能性。該方法能夠分離出具有更高生物活性的完整EVs。此外，還將討論大規模生產EVs所需的新工具以及基于該方法的定量和定性分析。

◆細胞外囊泡

細胞外囊泡是由各種組織和細胞分泌的被脂質雙層膜所包圍的膜囊泡的總稱。由于分泌路徑、生物合成和尺寸的不同，細胞外囊泡分為由多囊泡和細胞膜融合分泌到細胞外的外泌體（40-200 nm）；直接從細胞膜出芽并分泌到細胞外的微泡（200-1000 nm）；從發生細胞凋亡的細胞中分泌的凋亡小體（1000-5000 nm）這三類。我們可以從血液、尿液、唾液和腦脊液等體液中觀察-到細胞外囊泡，其中包含各種蛋白、核酸和脂質等，對于細胞間的信息傳遞尤為重要^1）。

近年來，眾多研究表明細胞外囊泡與惡性腫瘤、炎癥性疾病和神經疾病等疾病相關，因此在探索用于疾病診斷，預后預測的生物標志物和面向治療的應用研究中，細胞外囊泡備受期待^2）。此外，由于使用血液中細胞外囊泡的診斷屬于微創診斷，可減輕患者在長期觀察中的負擔，同時捕捉疾病的變化，所以急需開發此類診斷方法。

◆神經退行性疾病相關的細胞外囊泡

隨著年齡增長，神經退行性疾病的患病風險也會升高，所以對于老齡化日漸加劇的日本來說已是不容忽視的一類疾病。關于細胞外囊泡在阿爾茨海默病、帕金森病等神經退行性疾病中作用的研究，在近10年已取得顯著進展。

2006年Rajendran等人報告阿爾茨海默病病因之一的β淀粉樣蛋白存在于細胞外囊泡的內外，并且細胞外囊泡的特異性蛋白ALIX存在于阿爾茨海默病患者大腦內的淀粉樣斑塊^3）。2012年Saman等人發現在過度表達致病因子之一的Tau蛋白的細胞中，分泌的細胞外囊泡內存在Tau蛋白^4）。

筆者已確認阿爾茨海默病患者腦組織來源的細胞外囊泡中存在的Tau蛋白中對聚集體形成非常重要的Serine396發生了磷酸化（pS396 tau）。其與對照組比較有顯著地上升（圖1a，b）^5）。另外，還確認到其Tau蛋白是以寡聚體的狀態存在于細胞外囊泡內，作為小鼠、細胞實驗中用于傳播，聚集Tau的種子，與細胞外囊泡共同具有著重要的功能^6）。

此外，通過蛋白質組學分析了阿爾茨海默病的腦組織來源（蔗糖密度梯度離心法），腦脊液來源（MagCapture™ Exosome Isolation Kit PS；FUJIFILM Wako，293-77601）的細胞外囊泡，比較ANXA5、PTGFRN和對照組發現這些蛋白的表達有所上升（圖1c，d，e）^5，7）。

圖1. 神經退行性疾病中細胞外囊泡的功能和生物標記開發

（a）透射電子顯微鏡下的細胞外囊泡 （b）存在于細胞外囊泡內外的Tau和磷酸化Tau （c）基于蛋白質組學分析的蛋白質表達量比較 （d）阿爾茨海默病患者腦組織來源細胞外囊泡的ANXA5的表達上升 （e）腦脊液來源細胞外囊泡的生物標記候選蛋白

CTRL：健康　　MCI：輕度認知障礙　　AD：阿爾茨海默病性癡呆　　＊：p < 0.05

雖然使用腦脊液監測疾病是優選，但提取腦脊液對患者來說負擔沉重，所以希望能有微創的血液檢查。因此筆者等人考慮使用多個檢測樣品的血液樣品細胞外囊泡分析和評估候選蛋白，為了同時處理多個樣品，并且消除人工操作的誤差，我們開發了可自動純化體液來源細胞外囊泡的技術。

◆血清和血漿來源細胞外囊泡的自動純化技術開發

體液中含有大量的細胞外囊泡，考慮到其還包含了來源細胞的變化，因此使用大規模的臨床檢測樣品進行細胞外囊泡蛋白的全面蛋白質組學分析正在盛行。至今已報告許多從血液中濃縮細胞外囊泡的方法，例如組合式離心法、平衡密度梯度離心法、尺寸排阻色譜法、利用親和性的純化法等^8）。

由于不同方法分分離的細胞外囊泡也各異，而且含有雜質的比例也不同，所以可高純度純化細胞外囊泡的方法，以及標準化純化方法非常必要。

高純度純化和濃縮細胞外囊泡可以降低蛋白的動態范圍，能夠在蛋白質組學分析中定性和定量微量蛋白。此外，為了實現大規模臨床樣品的蛋白質組學分析，開發重復性高的純化系統尤為重要。

筆者等人通過使用96孔正壓萃取裝置對 96 份血清和血漿樣品進行過濾前處理，并在 KingFisher Flex系統上使用了 MagCapture™ Exosome Isolation Kit PS，成功開發了一次性純化96份樣品的自動純化技術（圖2）。

圖2. 使用MagCapture™ Exosome Isolation Kit PS開發細胞外囊泡的自動純化技術

◆血清和血液細胞外囊泡的蛋白質組學分析

筆者等人在通過對自動純化技術純化的細胞外囊泡進行了全面蛋白質組學分析，發現與手動純化相比，自動純化技術可以降低樣品間的差異，在提高細胞外囊泡標志物的離子強度的同時，還能大幅度降低血液蛋白中的載脂蛋白B的離子強度（圖3a）。

使用臨床樣品的分析中，成功定性了細胞外囊泡標志物在內的4079種蛋白，發現血清和血漿來源的細胞外囊泡中有部分蛋白的定量值差異較大（圖3b）^11）。需要根據研究目的選擇血清或血漿中的評估用蛋白。

圖3. 自動純化的血清和血漿來源細胞外囊泡的蛋白質組學分析

（a）手動和自動純化的細胞外囊泡標志物的比較 （b）血清和血漿來源細胞外囊泡的蛋白質組學分析的結果

目前，研究人員使用自動純化技術進行大規模臨床樣品的蛋白質組學分析，成功定性了腦組織來源細胞外囊泡的候選特異性標志物蛋白^11）。

◆結語

液體活檢可以從含有血液或尿液的體液中檢測或監測癌癥、退行性疾病和傳染病等，是一種備受期待的檢測、監測方法，因此將細胞外囊泡應用于液體活檢也備受矚目，期待今后可以得到進一步的研究和開發。血液細胞外囊泡的蛋白質組學分析，不僅在標志物的探索，在闡明病理的機制中也能發揮作用，對于大規模臨床樣品分析有著重要作用。

本次我們開發的自動純化技術可同時處理多個樣品，重復性優異，還可以抑制血液蛋白的污染。此外，我們還實現了蛋白質組學分析前處理的自動化（論文投稿中），有望為疾病生物標志物探索以及診斷試劑盒的開發提供新的技術。

◆謝辭

神經退行性疾病的細胞外囊泡的研究是在波士頓大學（現Mayo clinic）池津庸哉老師的帶領下進行的，細胞外囊泡的自動化純化是在富士膠片和光純藥株式會社的協助下在醫藥基礎研究所進行的。在此，表示衷心地感謝。