產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

本試劑盒采用E.coli polyA聚合酶對(duì)miRNA加尾，然后用特異引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，最后用熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行定量檢測(cè)，其原理示意圖如下：

產(chǎn)品特點(diǎn)：

1.兩步法（加尾-逆轉(zhuǎn)錄、染料法 qPCR），一步完成加尾-逆轉(zhuǎn)錄，然后檢測(cè)多個(gè) miRNA 靶分子。一次加尾-逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到的 cDNA 可以做上百次 PCR。

2.直接用總 RNA 為模板，不需要專門純化 miRNA，簡(jiǎn)單快捷。

3.檢測(cè)靈敏度可以達(dá)到幾百個(gè)拷貝/反應(yīng)。

4.能區(qū)分有 2-3 個(gè)堿基不同的 miRNA。

5.既可以定性，也可以定量。定量時(shí)線性范圍至少有 5 個(gè)數(shù)量級(jí)，但需要自備標(biāo)準(zhǔn)品。

6.既可以用總 RNA 為模板，也可以用總 miRNA 為模板。

7.用戶需要自備 miRNA 專一性的一條 PCR 上游引物。

8.本產(chǎn)品足夠 25 次 20uL 體系的加尾和逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，100 次 20uL 體系的染料法qPCR。

9.miRNA 染料法qRT-PCR試劑盒（polyA加尾法）只能用于科研。

產(chǎn)品參數(shù)：

成分規(guī)格包裝材料

加尾和逆轉(zhuǎn)錄 Mix

（含 dNTP 和 ATP）150 μL0.5mL 綠蓋管

miRNA-polyA RT 引物干粉0.5mL 本色管

E.coli polyA 聚合酶和

M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶混合液40 μL0.5mL 紅蓋管

miRNA PCR 通用下游引物  干粉0.5mL 黃色管

2×SYBR PCR MasterMix1 mL0.5mL 棕色管

超純水1 mL2.0mL 藍(lán)蓋管

使用手冊(cè)1 份無(wú)

運(yùn)輸及保存

低溫運(yùn)輸，-20℃保存，有效期一年。

自備試劑

總 RNA、miRNA 專一性上游引物（5pmol/μL in 水中）

使用方法：

一、設(shè)計(jì)、合成和分析自備的 miRNA 專一性上游引物

1.本試劑盒需要用戶自行設(shè)計(jì)一條 miRNA 靶分子專一性的上游引物跟試劑盒提供的通用引物共同使用，用超純水稀釋到 5pmol/μL 待用。

2.miRNA 專一性上游引物的 Tm 值決定后續(xù) PCR 的復(fù)性溫度，非常重要，故

必須準(zhǔn)確。可以通過(guò)網(wǎng)上的在線分析軟件（如 oligoanalyzer）計(jì)算 Tm，但最好實(shí)驗(yàn)測(cè)定，做法是將 100pmol miRNA 專一性上游引物和等量的互補(bǔ)引物

（不是下游引物）在 20μL 的本試劑盒提供的 2×SYBR PCR MasterMix 反應(yīng)體系中混合（參考第 9 步，只是不加模板，其他成分都加），直接進(jìn)行溶解曲線分析，測(cè)出在本試劑盒提供的反應(yīng)體系中的 Tm 值。當(dāng)軟件計(jì)算的 Tm 值和實(shí)驗(yàn)測(cè)試的 Tm 值有差異時(shí)，以后者為準(zhǔn)。

3.miRNA 專一性上游引物最好在 3 端比 miRNA 短幾個(gè)堿基。

4.可以選擇一個(gè)所研究物種的 5.8S rRNA 作為內(nèi)參，設(shè)計(jì)一條 5.8S rRNA 專一性的引物，同時(shí)做平行實(shí)驗(yàn)。

二、準(zhǔn)備總 RNA

5.用自選方法和試劑純化總 RNA，測(cè)定其濃度，最后用超純水將其稀釋到100ng/μL。總 RNA 樣品中殘留的 DNA 污染由于并沒(méi)有下游通用引物

（miRNA-polyA RT 引物）的結(jié)合位點(diǎn)，所以一般不會(huì)干擾基于本方法的

miRNA PCR 檢測(cè)。

三、加尾及逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)

6.按下表設(shè)置 RNA 加尾和逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，以 1 個(gè)樣品為例：

7.37℃保溫 1 小時(shí)。

8.加入 190μL 超純水使得總體積為 200μL（稀釋 20 倍），此樣品將作為 cDNA模板用于 PCR。未用完的 cDNA 20 倍稀釋樣品可以放-20℃至少兩年以上。

二、染料法 qPCR

9.按下表設(shè)置染料法 qPCR 反應(yīng)，最好每個(gè)反應(yīng)設(shè)置 3 個(gè)重復(fù)：

10.建議反應(yīng)程序設(shè)置如下：

11.分析溶解曲線分析所得 Tm（在 70-80℃之間一般表示擴(kuò)增是特異的），分析Ct 值，分析標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率和 R2（如果用陽(yáng)性對(duì)照做了標(biāo)準(zhǔn)曲線反應(yīng)的話）。

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