目錄:北京索萊寶科技有限公司>>生化檢測試劑盒-微量法>>微量法生化試劑盒>> BC2665-100T/48S多聚半乳糖醛酸酶(PG)檢測試劑盒 微量法
| CAS | 詳詢 | 純度 | 詳詢 |
|---|---|---|---|
| 分子量 | 詳詢 | 分子式 | 詳詢 |
| 供貨周期 | 現貨 | 規(guī)格 | 100T/48S |
| 貨號 | BC2665 | 應用領域 | 環(huán)保,化工,生物產業(yè),農林牧漁,綜合 |
| 主要用途 | 測定意義：多聚半乳糖醛酸酶（EC3.2.1.15）是一種細胞壁結合蛋白,可以催化 |
多聚半乳糖醛酸酶（PG）活性檢測試劑盒說明書
微量法
貨號: BC2665
規(guī)格:100T/48S
產品組成：使用前請認真核對試劑體積與瓶內體積是否一致，有疑問請及時聯系索萊寶工作人員。
試劑名稱 | 規(guī)格 | 保存條件 |
提取液 | 液體60 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
試劑一 | 液體10 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
試劑二 | 粉劑×1瓶 | 2-8℃保存 |
試劑三 | 液體20 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
標準品 | 粉劑×1支 | 2-8℃保存 |
溶液的配制：
1、 試劑一：若溶液中有晶體析出，37℃水浴溶解；
2、 試劑二：臨用前加入10 mL蒸餾水，60℃水浴助溶；
3、 標準品：10mg半乳糖醛酸。臨用前加入0.943 mL蒸餾水，配成50 μmol/mL的標準液；
產品說明：
多聚半乳糖醛酸酶（Ploygalacturonase，PG）屬果膠酶的一種，廣泛存在于植物、細菌及真菌中。其催化多聚半乳糖醛酸分解，在果實軟化、花粉授粉、種子發(fā)育成熟及器官脫落等方面具有重要作用，并且病原菌在侵染宿主植物時，可分泌多聚半乳糖醛酸酶來降解宿主細胞壁，進而導致病程發(fā)展。
PG水解多聚半乳糖醛酸生成半乳糖醛酸，半乳糖醛酸與DNS試劑反應生成在540 nm有特征吸收峰的棕紅色物質，測定540 nm處吸光值變化可計算得果膠酶活性。
注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。
需自備的儀器和用品：
可見分光光度計/酶標儀、低溫臺式離心機、水浴鍋、微量玻璃比色皿/96孔板、可調式移液槍、研缽/勻漿器、冰和蒸餾水。
操作步驟：
一、樣本處理（可適當調整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）
組織：按照質量（g）：提取液體積(mL)為1 : 5~10的比例（建議稱取約0.1 g，加入1 mL提取液）加入提取液，冰浴勻漿后于4℃，16000 g，離心10 min，取上清置于冰上待測。
細菌：先收集細菌到離心管內，離心后棄上清；按照細菌數量（104個）：提取液體積（mL）為500~1000︰1的比例（建議500萬個細菌加入1 mL提取液），冰浴超聲波破碎細菌（功率200 W，超聲3 s，間隔7 s，總時間5 min）；然后4℃，16000 g，離心10 min取上清置于冰上待測。
液體：直接檢測或用提取液稀釋后檢測。
二、測定步驟
1. 分光光度計/酶標儀預熱30 min以上，調節(jié)波長至540 nm，蒸餾水調零。
2. 將50 μmol/mL 標準液用蒸餾水稀釋為6、5、4、3、2、1.5 μmol/mL的標準溶液備用。
3. 操作表：（在1.5mL離心管中）
試劑名稱 (μL) | 測定管 | 對照管 | 空白管 | 標準管 |
樣本 | 25 | 25 | - | - |
蒸餾水 | - | - | 25 | - |
標準溶液 | - | - | - | 25 |
試劑一 | 50 | 50 | 50 | 50 |
試劑二 | 50 | - | 50 | 50 |
40℃ 水浴準確反應2 h后，沸水浴加熱10 min（蓋緊，防止水分散失），取出后冷卻至室溫。 | - | |||
試劑二 | - | 50 | - | - |
試劑三 | 125 | 125 | 125 | 125 |
沸水浴加熱5 min（蓋緊，防止水分散失），取出后冷卻至室溫。 | ||||
吸取200 μL反應液，測定540 nm處的吸光度，記為A測定管、A對照管、A空白管、A標準管，計算ΔA=A測定管-A對照管，ΔA標準=A標準管-A空白管。每個測定管需設一個對照管。 | ||||
三、PG酶活計算
1. 標準曲線的繪制：
以各個標準溶液的濃度為x軸，其對應的ΔA標準為y軸，繪制標準曲線，得到標準方程y= kx+b，將ΔA帶入方程得到x（µmol/mL）。
2. PG酶活的計算：
（1）按樣本蛋白濃度計算
酶活定義：在40℃，pH 6.0的條件下，每毫克蛋白每小時分解多聚半乳糖醛酸產生 1 μmol 的半乳糖醛酸定義為一個酶活力單位。
PG酶活（U/mg prot）= x×V提取÷（V提取×Cpr）÷T = 0.5x÷Cpr
（2）按樣本質量計算
酶活定義：在40℃，pH 6.0的條件下，每克樣本每小時分解多聚半乳糖醛酸產生 1 μmol 的半乳糖醛酸定義為一個酶活力單位。
PG酶活（U/g 質量）= x×V提取÷W÷T = 0.5x÷W
（3）按照細菌數量計算
酶活定義：在40℃，pH 6.0的條件下，每104個細菌每小時分解多聚半乳糖醛酸產生 1 μmol 的半乳糖醛酸定義為一個酶活力單位。
PG酶活（U/104 cell）= x×V提取÷T÷細菌數量（萬個）=0.5x÷細菌數量（萬個）
（4）按液體體積計算
酶活定義：在40℃，pH 6.0的條件下，每mL樣本每小時分解多聚半乳糖醛酸產生 1 μmol 的半乳糖醛酸定義為一個酶活力單位。
PG酶活（U/mL）= x×V樣÷V樣÷T = 0.5x
V提取：加入提取液體積，1 mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；W：樣本質量，g；V樣：反應體系中樣本體積，0.025 mL；T：酶促反應時間，2 h。
注意事項：
1、 樣本提取上清液置于冰上待測，且樣本提取完成后建議當天提取當天內測完。
2、 當A大于2時，建議將樣本用提取液稀釋后再進行測定，并在計算公式中乘以相應稀釋倍數。
3、 植物果實組織建議將樣本稀釋10倍或20倍后再測定。
4、 若樣本ΔA值偏小，建議延長酶促反應時間，并在計算公式中除以相應時間。
實驗實例：
1、 取0.1g木槿花加入1mL提取液冰浴勻漿后于4℃，16000 g，離心10 min，取上清稀釋2倍后按照測定步驟操作，用微量石英玻璃比色皿測得計算ΔA=A測定管-A對照管=1.6843-1.4916=0.1927，帶入標準曲線y=0.2426x-0.2979，計算得x=2.022µmol/mL，按樣本質量計算：
PG酶活（U/g質量）= 0.5x÷W×2（稀釋倍數）=20.22 U/g質量。
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