目錄:北京索萊寶科技有限公司>>生化檢測試劑盒-微量法>>微量法生化試劑盒>> BC4425-100T/96S吡咯啉-５-羧酸合成酶活性檢測試劑盒 微量
| CAS | 詳詢 | 純度 | 詳詢 |
|---|---|---|---|
| 分子量 | 詳詢 | 分子式 | 詳詢 |
| 供貨周期 | 現貨 | 規格 | 100T/96S |
| 貨號 | BC4425 | 應用領域 | 環保,化工,生物產業,農林牧漁,綜合 |
| 主要用途 | 吡咯啉 -５- 羧酸合成酶(P5CS)活性檢測 |
1-吡咯啉-５-羧酸合成酶（P5CS）活性檢測試劑盒說明書
微量法
貨號：BC4425
規格：100T/96S
產品組成：使用前請認真核對試劑體積與瓶內體積是否一致，有疑問請及時聯系索萊寶工作人員。
試劑名稱 | 規格 | 保存條件 |
提取液一 | 液體110 mL×1瓶 | |
提取液二 | 液體1.1 mL×1支 | -20℃保存 |
試劑一 | 液體15 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
試劑二 | 液體5 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
試劑三 | 粉劑×3支 | |
試劑四 | 粉劑×1瓶 | -20℃保存 |
溶液的配制：
1、試劑三：臨用前取1支加入0.833 mL蒸餾水溶解，現配現用。-20℃分裝保存；-20℃保存一周；
2、試劑四：臨用前加入3 mL蒸餾水溶解，現配現用。-20℃分裝保存；-20℃保存一周。
產品說明：
在干旱、鹽漬化、重金屬、紫外線等不同的脅迫條件下，均會誘導植物體內脯*酸的積累，對植物起到保護作用。高等植物中，脯*的合成有兩條途徑，分別以谷/酸和鳥*酸為前體。谷/酸途徑主要負責脅迫條件下脯*酸的積累，而鳥*酸途徑主要在氮充足條件下起作用，與脅迫情況下脯*酸的積累沒有關系。
1-吡咯啉-5-羧酸合成酶（P5CS）是脯*酸的谷/酸合成途徑中的關鍵酶，P5CS是一個雙功能酶，在NADPH和ATP作用下，可催化谷/酸磷酸化及/氨酸 γ-半醛還原，通過測定NADPH在340 nm處吸光度的變化，可計算出P5CS的活性高低。
Glutamate+Glutamate Gamma-Semialdehyde+NADPH(340nm)+ ATP Compound
注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。
需自備的儀器和用品：
紫外分光光度計/酶標儀、低溫離心機、水浴鍋/恒溫培養箱、微量石英比色皿/96孔UV板、可調式移液槍、研缽/勻漿器、冰和蒸餾水、EP管。
操作步驟：
一、樣本處理（可適當調整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）
組織樣本：按質量（g）︰提取液體積（mL）1︰5~10比例（建議稱取0.1 g樣本，加入1.0 mL提取液一）加入提取液一，冰浴勻漿后加入10 μL提取液二，于4℃，8000 rpm，離心15 min，棄沉淀，取上清液置于冰上待測。
二、測定步驟
1、 分光光度計/酶標儀預熱30 min以上，調節波長至340 nm，蒸餾水調零。
2、 將試劑三、試劑四置于冰上待測。
3、 操作表：（在微量石英比色皿/96孔UV板中操作）
試劑名稱（μL） | 空白管 | 測定管 |
蒸餾水 | 20 | - |
樣本 | - | 20 |
試劑一 | 120 | 120 |
試劑二 | 20 | 20 |
試劑三 | 20 | 20 |
試劑四 | 20 | 20 |
在微量石英比色皿/96孔UV板中分別加入上述試劑，充分混勻后于340 nm處測定10s時的吸光值A1，迅速置于37℃水浴鍋/37℃培養箱放置5min（酶標儀有控溫功能的將溫度調制37℃），拿出迅速擦干測定5min10s時的吸光值A2，計算ΔA測定管= A1測定-A2測定，ΔA空白管=A1空白-A2空白，ΔA=ΔA測定管-ΔA空白管。 | ||
注意：空白管只需測定1-2次。
三、P5CS酶活計算
1、按樣本蛋白濃度計算
酶活單位定義：每毫克組織蛋白每分鐘消耗1 nmol NADPH為一個酶活單位。
P5CS酶活（U/mg prot）=ΔA÷ε÷d×V反總×109÷(V樣×Cpr)÷T =321.54×ΔA÷Cpr÷d
2、按樣本質量計算
酶活單位定義：每克組織每分鐘消耗1 nmol NADPH為一個酶活單位。
P5CS酶活（U/g 質量）= ΔA÷ε÷d×V反總×109÷(W×V樣÷V樣總)÷T =324.76×ΔA÷W÷d
ε：NADPH摩爾消光系數，6.22×103 L/mol/cm；d：微量比色皿光徑，1 cm/96孔UV板光徑，0.6 cm；V反總：反應體系總體積，2×10-4L；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；V樣：加入反應體系中上清液體積，0.02 mL；V樣總：加入提取液體積，1.01 mL；W：樣本質量，g；T：反應時間，5 min；109：單位換算系數，1mol=109nmol。
注意事項：
1、當A1測定高于1.5或者ΔA大于0.5時，建議將樣本稀釋后檢測，并在計算公式中乘以稀釋倍數。
2、盡量使用新鮮樣本進行檢測，操作時請置于冰上操作。
3、ΔA空白管的數值一般不超過0.05。
實驗實例：
1、取0.1g三葉草進行樣本處理，樣本稀釋2倍，按照測定步驟操作（微量石英比色皿檢測），計算得ΔA測定管= A1測定-A2測定=1.0302-0.9842=0.046，ΔA空白管=A1空白-A2空白=0.7431-0.7248=0.0183，ΔA=ΔA測定管-ΔA空白管=0.0277，按照樣本質量計算酶活得：
P5CS酶活（U/g 質量）=324.76×ΔA÷W=179.9U/g 質量。
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