目錄:北京索萊寶科技有限公司>>生化檢測試劑盒-微量法>>微量法生化試劑盒>> BC5855-100T/96S丙酮酸磷酸雙激酶活性檢測試劑盒 微量法
| CAS | 詳詢 | 純度 | 詳詢 |
|---|---|---|---|
| 分子量 | 詳詢 | 分子式 | 詳詢 |
| 供貨周期 | 現貨 | 規格 | 100T/96S |
| 貨號 | BC5855 | 應用領域 | 環保,化工,生物產業,農林牧漁,綜合 |
| 主要用途 | 丙酮酸磷酸雙激酶活性檢測 |
丙酮酸磷酸雙激酶（PPDK）活性檢測試劑盒說明書
微量法
貨號：BC5855
規格：100T/96S
產品組成：使用前請認真核對試劑體積與瓶內體積是否一致，有疑問請及時聯系索萊寶工作人員。
試劑名稱 | 規格 | 保存條件 |
提取液 | 液體110 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
試劑一 | 液體15 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
試劑二 | 粉劑×1支 | -20℃保存 |
試劑三 | 液體1.1 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
試劑四 | 粉劑×1支 | 2-8℃保存 |
試劑五 | 粉劑×1支 | -20℃保存 |
試劑六 | 液體45 μL×1支 | 2-8℃保存 |
溶液的配制：
1、 試劑二：臨用前加入1.1mL蒸餾水充分溶解，未用完的試劑-20℃分裝保存4周，避免反復凍融。
2、 試劑四：臨用前加入1.1mL蒸餾水充分溶解，未用完的試劑-20℃分裝保存4周，避免反復凍融。
3、 試劑五：臨用前加入1.25mL蒸餾水充分溶解，未用完的試劑-20℃分裝保存4周，避免反復凍融。
4、 試劑六工作液：臨用根據樣本量按照試劑六：蒸餾水=5μL：120μL（共125μL，25T）的比例配制成，現配現用。
5、 工作液的配制：臨用前按樣本量將試劑二：試劑三：試劑四：試劑五：試劑六工作液=0.25mL：0.25mL：0.25mL：0.25mL：0.25mL（共1.25mL，約25T）配制成工作液使用，現配現用。
產品說明：
丙酮酸磷酸雙激酶（pyruvate phosphate dikinase，PPDK，EC 2.7.9.1）是C4途徑和景天科酸代謝途徑的限速酶，催化ATP、丙酮酸和Pi經三步反應生成磷酸烯醇式丙酮酸。該酶主要存在于C4植物的葉綠體基質中，對光合功能具有重要調節作用。
PPDK的逆向反應催化磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）、AMP和PPi生成丙酮酸、ATP和Pi，乳酸脫氫酶（LDH）進一步催化丙酮酸和NADH生成乳酸和NAD+，在340nm測定NADH減少速率，據此可以計算PPDK活性。
注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。
需自備的儀器和用品：
紫外分光光度計/酶標儀、微量石英比色皿/96孔UV板、天平、低溫離心機、水浴鍋、研缽/勻漿器、冰和蒸餾水。
操作步驟：
一、樣本處理（可適當調整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）
1. 組織：按照組織質量（g）：提取液體積（mL）為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液）
進行冰浴勻漿。12000g，4℃離心 10min，取上清置于冰上待測。
二、測定步驟
1、 紫外分光光度計/酶標儀預熱30min以上，調節波長至340nm，分光光度計用蒸餾水調零。
2、 試劑一37℃預熱10min.
3、 操作表：（在微量石英比色皿/96孔UV板中依次加入）
試劑名稱（μL） | 空白管 | 測定管 |
試劑一 | 130 | 130 |
工作液 | 50 | 50 |
樣本 | - | 20 |
提取液 | 20 | - |
在微量石英比色皿/96孔UV板中分別加入上述試劑，充分混勻后記錄340nm下10s時的初始吸光度A1空白、A1測定，之后迅速將比色皿連同反應液一起置于37℃水浴中準確反應5min，迅速取出，340nm下記錄5min10s時的吸光度A2空白、A2測定，計算ΔA測定=A1測定-A2測定，ΔA空白=A1空白-A2空白，ΔA=ΔA測定-ΔA空白。空白管只需做1-2次。 | ||
三、丙酮酸磷酸雙激酶（PPDK）計算公式
1. 使用96孔UV板測定：
（1） 按樣本蛋白濃度計算：
酶活定義：每mg組織蛋白在反應體系中每分鐘減少1nmol NADH定義為一個酶活力單位。
PPDK活性（U/mg prot）=ΔA÷（ε×d）×V反×109÷（Cpr×V樣）÷T×F =535.91×ΔA÷Cpr×F
（2） 按樣本質量計算：
酶活定義：每g組織在反應體系中每分鐘減少1nmol NADH定義為一個酶活力單位。
PPDK活性（U/g 質量）=ΔA÷（ε×d）×V反×109÷（W÷V提取×V樣）÷T×F =535.91×ΔA÷W×F
ε：NADH摩爾消光系數，6.22×103 L/(mol·cm)；d：96孔板光徑，0.6cm；V反：反應體系體積，2×10-4L；V樣：反應體系中加入的樣本體積，0.02mL；V提取：加入提取液的體積，1mL；T：反應時間，5min；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；W：樣本質量，g；F：稀釋倍數；109：單位換算，1mol=109nmol。
2. 使用微量比色皿測定：
將上述公式中的d=0.6cm改為d=1cm（微量比色皿光徑）進行計算即可。
注意事項：
1. 測定過程中樣本和工作液在冰上放置，以免變性和失活。
2. 最好兩個人同時做此實驗，一個人比色，一個人計時，以保證實驗結果的準確性。
3. 當樣本ΔA＜0.005時，可適當延長酶促反應時間或增大樣本量后測定；當樣本ΔA>0.6時，可用蒸餾水稀釋上清液后測定，注意同步修改計算公式中的稀釋倍數。
實驗實例：
1、 取0.1014g高粱葉片加入1mL提取液進行冰浴勻漿，取上清用蒸餾水稀釋4倍后，按照測定步驟操作，用96孔UV板測得ΔA空白=A空白1-A空白2=0.754-0.749=0.005，ΔA測定=A測定1-A測定2=0.811-0.478=0.333，ΔA=ΔA測定-ΔA空白=0.333-0.005=0.328，按樣本質量計算PPDK活性得：
PPDK活性（U/g 質量）=535.91×ΔA÷W×F =6934.06 U/g 質量。
2、 取0.1086g柚子葉片加入1mL提取液進行冰浴勻漿，取上清后按照測定步驟操作，用96孔UV板測得ΔA空白=A空白1-A空白2=0.754-0.749=0.005，ΔA測定=A測定1-A測定2=1.849-1.530=0.319，ΔA=ΔA測定-ΔA空白=0.319-0.005=0.314，按樣本質量計算PPDK活性得：
PPDK活性（U/g 質量）= 535.91×ΔA÷W×F =1549.50U/g 質量。
參考文獻：
[1] Chris J. Chastain and others, Functional evolution of C4 pyruvate, orthophosphate dikinase, Journal of Experimental Botany, Volume 62, Issue 9, May 2011, Pages 3083–3091
[2] Chastain, C.J., Heck, J.W., Colquhoun, T.A. et al. Posttranslational regulation of pyruvate, orthophosphate dikinase in developing rice (Oryza sativa) seeds. Planta 224, 924–934 (2006).
[3] Aoyagi K, Bassham JA. Pyruvate orthophosphate dikinase in wheat leaves. Plant Physiol. 1983 Nov;73(3):853-4.
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