凝膠滲透色譜的分離過程是在裝有多孔物質為填料的色譜柱中進行的，一個填料的顆料含有許多不同尺寸的小孔（這些小孔具有一定的分布），這些小孔對于溶劑分子來說是很大的，它們可以自由地擴散出入。由于高聚物在溶液中以無規線團的形式存在，且高分子線團也具有一定的尺寸，當填料上的孔洞尺寸與高分子線團的尺寸相當時，高分子線團就向孔洞內部擴散。顯然，尺寸大的高聚物分子，由于只能擴散到尺寸大的孔洞中，在色譜柱中保留的時間就短；而尺寸小的高聚物分子，幾乎能夠擴散到填料的所有的孔洞中，向孔內擴散的較深，在色譜柱中保留的時間就長。因此，不同分子量的高聚物分子就按分子量從大到小的次序隨著淋洗液的流出而得到分離。
凝膠具有化學惰性，它不具有吸附、分配和離子交換作用。讓被測量的高聚物溶液通過一根內裝不同孔徑的色譜柱，柱中可供分子通行的路徑有粒子間的間隙（較大）和粒子內的通孔（較小）。當聚合物溶液流經色譜柱（凝膠顆粒）時，較大的分子（體積大于凝膠孔隙）被排除在粒子的小孔之外，只能從粒子間的間隙通過，速率較快；而較小的分子可以進入粒子中的小孔，通過的速率要慢得多；中等體積的分子可以滲入較大的孔隙中，但受到較小孔隙的排阻，介乎上述兩種情況之間。經過一定長度的色譜柱，分子根據相對分子質量被分開，相對分子質量大的在前面（即淋洗時間短），相對分子質量小的在后面（即淋洗時間長）。自試樣進柱到被淋洗出來，所接受到的淋出液總體積稱為該試樣的淋出體積。當儀器和實驗條件確定后，溶質的淋出體積與其分子量有關，分子量愈大，其淋出體積愈小。
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