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細胞凍存實驗重點干貨分享

閱讀:226          發布時間:2024-5-27

        細胞凍存是指將細胞放在低溫環境,以達到減少細胞代謝的作用,從而達到對細胞進行長期儲存進行保種的目的,以供后續實驗或臨床使用。細胞凍存一般采用慢凍原則,慢凍可使細胞逐步脫水,細胞不會因為產生大的冰晶而收到損害。


一、原理

當溫度低至-70℃時,細胞內的代謝活動及酶活性幾乎全部停止,低于-130℃時,細胞能達到最佳存活率。液氮可實現細胞的長期保存。

冷凍保護劑二甲基亞砜(DMSO)能快速穿透細胞膜進入細胞,降低冰點,延緩凍存過程,同時增加細胞膜的通透性,提高細胞內離子濃度,減少細胞內冰晶的形成,從而達到保護細胞的目的。


二、貼壁細胞凍存操作步驟

1、預熱凍存液;

2、用PBS沖洗細胞,加入胰酶消化(此步驟同細胞傳代操作);

3、終止消化后,重懸細胞,轉移至無菌EP管,1000rpm離心5min;

4、棄上清,加入預熱的細胞凍存液,細胞凍存最佳密度為5×10^6~1×10^7/ml,一般不低于5×10^5/ml;

5、分裝完畢后,擰緊凍存管蓋并做好標記;

6、將分裝好的凍存管轉入程序降溫盒,放入-80℃冰箱過夜;

7、將凍存管轉移至液氮長期保存。


三、懸浮細胞凍存操作步驟

1、用移液管將細胞懸液吹吸均勻,將細胞懸液移入離心管;

2、1000rpm離心 3 min,收集細胞沉淀;

3、用預熱的凍存液重懸細胞,細胞凍存最佳密度為3-5×10^6/ml,一般不低于5×10^5/ml;

4、分裝完畢后,擰緊凍存管蓋并做好標記;

5、將分裝好的凍存管轉入程序降溫盒,放入-80℃冰箱過夜;

6、將凍存管轉移至液氮長期保存。

QQ截圖20240527153159.jpg

貼壁細胞凍存操作示意圖

注意事項:

① 細胞培養、傳代以及凍存需要嚴格的無菌操作。

② 傳代時需要適度的消化,消化的時間受消化液的種類、配制時間、加入培養瓶中的量等諸多因素的影響,消化過程中應該注意培養細胞形態的變化,一旦胞質回縮,連接變松散,或有成片浮起的跡象就要立即終止消化。

③ 傳代應在細胞處于對數期、未達到匯合狀態時進行。

④ 細胞凍存液需提前配制,不可直接將DMSO加入細胞懸液中。

⑤ 應選擇匯合度80%-90%左右,并且活力達90%以上處于對數生長期時的細胞進行凍存操作,確保細胞凍存時狀態最佳,凍存密度可根據細胞特性進行調整。

⑥ 程序凍存盒、細胞凍存液、全培養基等試劑都要復溫至室溫備用。

⑦ 凍存前注意切勿消化時間過長、吹打力度過重、離心轉速過大或離心時間過長,以免造成細胞損傷。

⑧ 凍存管的蓋子一定要擰緊,否則水浴復蘇時水會滲入造成污染。

⑨ 細胞不可長期保存在-80℃冰箱中,放置時間不要超過3天。

⑩ 液氮或冰箱距離細胞房較遠,細胞需要放在干冰或冰盒上運送至細胞房。


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