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細(xì)胞CDK2/CYCLIN A激酶活性熒光共振能量轉(zhuǎn)移法定量
閱讀：1219 發(fā)布時(shí)間：2015-4-7| 提 供 商 | 上海哈靈生物科技有限公司 | 資料大小 | 71.1KB |
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| 資料類型 | WORD 文檔 | 瀏覽次數(shù) | 1219次 |
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主要用途
細(xì)胞CDK2/CYCLIN A激酶活性熒光共振能量轉(zhuǎn)移法（FRET）定量檢測(cè)試劑是一種旨在通過熒光探針EDANS供體和DABCYL受體雙重標(biāo)記的多肽底物，在CDK2/CYCLIN E抑制劑的存在下，受到CDK2/CYCLIN A的磷酸化后，不能被位點(diǎn)特異性氨基肽酶切離，而發(fā)生熒光峰值的降低，即采用熒光共振能量轉(zhuǎn)移法來測(cè)定樣品中酶活性的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種細(xì)胞裂解萃取液樣品（動(dòng)物、人體）、部分或*純化酶樣品中CDK2/CYCLIN A激酶的特異活性定量檢測(cè)，以及抑制劑和激活劑的篩選。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌，即到即用，操作簡(jiǎn)捷，性能穩(wěn)定，安全可靠。
技術(shù)背景
細(xì)胞周期素依賴性激酶2（cyclin dependent kinase 2；CDK2；EC 2.7.11.22），又稱為細(xì)胞分裂周期蛋白1（cell division cycle1；CDC1）或p33，屬于絲氨酸/蘇氨酸激酶（serine/threonine protein kinase）家屬成員之一。其與酵母細(xì)胞的cdc28和cdc2高度進(jìn)化保留。細(xì)胞周期素依賴性激酶2的催化亞體，與細(xì)胞周期素E然后A結(jié)合，允許細(xì)胞由G1期進(jìn)入DNA合成期，達(dá)到調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、DNA復(fù)制、細(xì)胞分裂等。p21Cip1 （CDKN1A）and p27Kip1 （CDKN1B）是CDK2激酶的抑制劑。CDK2/CYCLIN A激酶的磷酸化目標(biāo)序列為HHASPRK。基于磷酸化多肽具有抗氨基肽酶切離的功能，通過熒光共振能量轉(zhuǎn)移法（Fluorescence resonance energy transfer；FRET），即傳遞激發(fā)狀態(tài)的能量由處于較短波長(zhǎng)的供體（donor）到覆蓋供體波長(zhǎng)的受體（acceptor），使得距離依賴性反應(yīng)的供體的散發(fā)光子淬滅（quench），使用2個(gè)熒光探針EDANS供體和DABCYL受體作為FRET對(duì)，來標(biāo)記的CDK2多肽底物的兩端，在氨基肽酶（aminopeptidase）的作用下，釋放出強(qiáng)烈熒光的EDANS；一旦在CDK2/CYCLIN E抑制劑二氨基吡唑-1氫4-基偶氮酚【4-（3,5-diamiH-pyrazol-4-ylazo）-phenol】的存在下，底物受到CDK2/CYCLIN A的磷酸化（由ATP的γ-磷酸根到多肽上單一絲氨酸殘基分子上），底物將不能被位點(diǎn)特異性氨基肽酶切離，而無法釋放出EDANS，由此根據(jù)產(chǎn)物熒光強(qiáng)度（激發(fā)波長(zhǎng)340nm，散發(fā)波長(zhǎng)490nm）的降低，來定量測(cè)定細(xì)胞周期素依賴性激酶2/細(xì)胞周期素A的特異活性。CDK2/CYCLIN A反應(yīng)系統(tǒng)為：