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在新的樣品類型中，如何驗證樣品的稀釋和實現線性
閱讀：4466 發布時間：2018-12-20
◆免疫分析樣品的驗證實驗——什么是基質干擾？
酶聯免疫吸附測定（ELISA）是一種基于微孔板的技術，常用于檢測和定量各種生物樣品中人們所感興趣的低豐度待測分析物。該技術取決于兩個要素：（1）通過由酶和標記二抗結合所產生的比色產物的顯影來高度準確地測定抗體-抗原間的相互作用；（2）基于上述相同的相互作用，以標準參考重組蛋白制作標準曲線， 然后再與之前的結果準確比對，從而得出生物樣品中待測物的濃度。
在市售的ELISA試劑盒中，準確測量分析物的關鍵，是對您的*樣品和（或）未經試劑盒制造商驗證的樣品進行測試。由于不同的抗體-分析物有不同的結合特征，且目標分析物中樣品基質的背景中存在固有內源物質的差異，可能會使得這些樣品難以用試劑盒中的抗體獲得穩健的檢測和定量效果。這稱為樣品的基質干擾。這些干擾物質是結構相似但化學性質有差異的化合物，它會與靶向目標分析物發生抗體交叉反應。
受到這種干擾時，樣品基質中內源性干擾物質或外源性污染物會導致光學密度（OD值）錯誤地增加或減少，不能反映分析物濃度真實水平。會產生基質干擾的樣品包括一些富含蛋白質的樣品，或一些具有潛在基質干擾的樣品， 如尿液、細胞裂解液和血液成分（血清和血漿）。
除了樣品固有的內源性物質和由于人為錯誤產生的外源性污染物之外，使用者可能還需要評估測定用的稀釋緩沖液與潛在的干擾組分之間的相容性。干擾組分可以是pH依賴性的、去垢型的或有機溶劑型的，緩沖溶液鹽的組成和濃度會決定緩沖液的相容性。有時候可能需要更換緩沖液來排除干擾，以便能檢測樣品中分析物的真實濃度。另一方面，當分析物的水平顯著升高到超過測定的定量限（LOQ）時，優化樣品的稀釋度成為克服這種干擾的一種策略。為了確保樣品能準確地檢測和定量，并減輕樣品基質效應，終端用戶可能需要考慮通過加標-回收以及稀釋線性實驗來進行樣品檢驗。
◆加標-回收實驗
加標和回收實驗的主要目標，是確定分析物的檢測是否受到使用者制備標準曲線時所用的測定稀釋劑/緩沖液與樣品基質之間的差異的影響。樣品基質可以是純的（未稀釋的）生物樣品或以測定稀釋劑稀釋的生物樣品。這是通過將已知量的重組蛋白質標準品加入天然測試樣品基質中（加標），并觀察其相對于向測定稀釋劑中加入相同已知量的重組蛋白質標準品的響應（回收）來實現的。
響應（終濃度）可以根據添加的重組蛋白質標準物的量從標準曲線和OD值來計算得出。在運行兩組響應并從標準曲線計算出濃度后，終端用戶可以計算出回收百分比，以確定觀察到的加標樣品值與觀察到的未加標樣品值相對于實際已知量的百分比偏差，從而確定稀釋劑和樣品基質的兼容性。
作為使用者，他們希望在樣品基質和測定稀釋劑/緩沖液中對給定的目標分析物實現相同的響應。換句話說，*相容的樣品基質應該獲得100％的回收率，因為加標后所觀察到的回收率在稀釋劑測定時和樣品基質測定時所獲得的回收率是應該相同的。
回收率大可能會偏離20％。如果回收的值與預期的量有顯著出入（根據加入已知的量來計算得出），那么與100％回收率對比所發生的偏差可能能夠表明稀釋劑與樣品基質的不相容性/差異程度，在這種情況下必須進行調整來盡量減少偏差。在樣品回收率非常差的情況下， 建議使用其他不同的、其組成與樣品基質更加接近的分析稀釋劑。
◆稀釋線性實驗
如樣品在系列稀釋下未呈現出線性，則表明在給定稀釋度下，基質組分干擾了對目標分析物的準確檢測。因此，使用者將樣品稀釋至觀察不到干擾時，有必要校正稀釋因子。進行稀釋線性實驗是為了證明，加標濃度高于定量上限的樣品可稀釋至工作標曲范圍內的濃度，并仍可以產生準確可靠的結果。
鉤狀效應所帶來的不良線性，也可通過實現稀釋線性來減輕。當分析物的濃度開始超過抗體的量時，會產生鉤狀效應。這時候，隨著分析物濃度開始遠遠超出可用的抗體的量時，劑量反應曲線的平臺在進一步增長時的斜率會開始變負，說明出現了潛在的基質干擾且的分析物濃度定量的準確性開始降低。
使用合適的、精選的稀釋劑在分析范圍內來對樣品進行系列梯度稀釋。當稀釋線性出現時，連續的稀釋點OD值會出現線性變化，或者每個稀釋點乘以稀釋倍數后，將計算得到大致相同的樣品濃度。例如，如果使用者進行兩倍連續稀釋，則每個點之間的OD值大致應該有兩倍的差異。對于已知小所需稀釋度（MRD）的已測樣品，在理論上該值可作為起始點，然后通過一系列的稀釋來確定該起始點是否合適。如果樣品尚未經過檢測，則可能需要通過以一個更大范圍的稀釋度的滴定來確定MRD， 從而實現線性。稀釋線性能保證測試的高度準確性并且表明該測試在不同稀釋度下具有靈活性。
進行稀釋線性實驗也可以通過制備幾種具有低濃度分析物的樣品的稀釋液，將已知量的相同分析物摻入每一個稀釋液中，然后通過比較未加標和（或）未稀釋樣品的所觀察到的值和預期的值，從而來測試和評估測定回收率。在稀釋后，擁有理想線性的樣品，所被觀察到的樣品濃度相對于其終濃度來說不應該出現變化。當樣品回收率可在預期值的80％至120％范圍之內，即可實現線性。考慮到稀釋數據在測定范圍內的低端會有統計學上的限制，因此應該避免有低于測定中定量限兩倍的值。
◆總結
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