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Cy3 TUNEL Assay Apoptosis Detection Kit

產品描述
　　細胞凋亡的一個顯著特點是細胞染色體 DNA 的降解，這是一個較普遍的現象。這種降解非常特異并有規律，所產生的不同長度的 DNA 的片段約為 180 bp-200 bp 的整數倍，表現為瓊脂糖凝膠電泳中呈現特異的梯狀 Ladder 圖譜，Cy3 TUNEL Assay Apoptosis Detection Kit試劑盒采用 TUNEL 法，應用末端脫氧核糖核苷酸轉移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT)在凋亡細胞斷裂DNA 的3′-OH末端催化摻入Cy3-dUTP。 Cy3-dUTP標記的 DNA 可以用熒光顯微鏡直接觀察或者用流式細胞儀定量。 TUNEL 法可以選擇性的檢測凋亡細胞， 而非壞死細胞或因輻照和藥物治療而造成的 DNA 鏈斷裂的細胞。TUNEL 實驗中， TdT 酶催化 dUTP 摻入斷裂的 DNA 鏈的3′-OH末端。抗原標記的 dUTP（如digoxin-dUTP、生物素-dUTP），因為它可以直接進行原位檢測，是一種更快速、直接的檢測手段。
訂購信息

產品組分

保存方法
　　本產品應置于-20℃儲存；TUNEL Reaction Buffer 避光儲存于-20℃，避免反復凍融。有效期見外包裝。
【注】：TUNEL Equilibration Buffer和TUNEL Reaction Buffer中含有有毒、致癌成分Sodium cacodylate trihydrate和Cobaltous chloride，使用時請佩戴口罩、手套，接觸皮膚后，請立即有大量水沖洗，廢液請按有毒物質處理。
實驗材料（自備）
PBS 緩沖液（pH～7.4）
4%多聚甲醛（in PBS）
牛血清白蛋白(BSA) 或正常的羊、牛血清
70%乙醇（自選）
脫蠟溶劑（石蠟切片樣本）
蛋白酶K（石蠟切片樣本）
操作步驟
1.樣本準備：
細胞樣品
（1）可選：準備一份陰性對照樣本（加入不含 TdT 酶的TUNEL 反應液）。
（2）PBS清洗細胞兩次。
（3）細胞固定：加入適量 4%多聚甲醛(pH 7.4)溶液， 4℃ 放置 30 min。
（4）PBS清洗細胞兩次。
（5）通透細胞：加入冰上預冷的 70%乙醇，在-20℃孵育 4 h。細胞能在 70%乙醇中-20℃的條件下保存一周。或者細胞可用配制于 PBS 中的 0.2% Triton X-100 溶液通透，室溫放置 20 min。
（6）PBS清洗細胞兩次。
石蠟組織切片
（1）室溫下用二甲苯浸泡石蠟組織切片2次，每次5 min， 以*脫掉石蠟。
【注】：二甲苯有毒，易揮發，請在通風櫥中進行此操作。
（2）室溫下，將切片樣本浸沒于無水乙醇中漂洗2次，每次5 min。
（3）室溫下，將切片樣本連續浸沒在不同濃度梯度的乙醇（95%、90%、80%、70%）中，每種濃度各漂洗1次，每次5 min。
（4）室溫下，將切片浸沒于純水中漂洗1次，每次3 min，再將切片浸沒于1×PBS中漂洗1次，每次3 min，用濾紙小心吸干切片樣本周圍多余液體。
（5）用免疫組化筆在切片樣本周圍描繪樣品輪廓，以便下游通透與標記。
（6）按1:100的比例， 將2 mg/mL的Proteinase K溶液用1 × PBS稀釋， 使其終濃度為20 µg/mL。每個樣本上滴加100 µL稀釋好的Proteinase K溶液， 使溶液覆蓋全部樣本區域， 室溫孵育20 min（Proteinase K 的孵育時間、溫度需根據不同類型組織樣本進行優化）。
【注】：蛋白酶K可以幫助滲透組織，但延長孵育時間可能導致切片脫落，所以要優化孵育時間長短。時間一般為10~30 min，4 µm左右的片子可以用10 min，但30 µm左右的可用30 min。過長易脫片、過短起不到通透效果。
（7）PBS 浸潤清洗切片兩次，每次 5 min，用濾紙吸去多余的液體，將處理好的樣品放在濕盒中保持濕潤。
【注】：這一步必須把蛋白酶K洗滌干凈，否則會嚴重干擾后續的標記反應。
冰凍組織切片
（1）將冰凍切片放置于室溫的片架上，室溫20 min，晾干。
（2）將載玻片浸沒在4%多聚甲醛溶液（in PBS）中，室溫固定30 min。
（3）PBS 浸潤清洗切片兩次，每次5 min。
（4）用濾紙小心吸干載玻片上樣本周圍的液體。
（5）按1:100的比例， 將2 mg/mL的Proteinase K溶液用1 × PBS稀釋， 使其終濃度為20 µg/mL。每個樣本上滴加100 µL稀釋好的Proteinase K溶液， 使溶液覆蓋全部樣本區域，室溫孵育10 min（Proteinase K 的孵育時間、溫度需根據不同類型組織樣本進行優化）。
【注】：蛋白酶K可以幫助滲透組織，但延長孵育時間可能導致切片脫落，所以要優化孵育時間長短。時間一般為10~30 min，4 µm左右的片子可以用10 min，但30 µm左右的可用30 min，需摸索合適時間。過長易脫片、過短起不到通透效果。
（6）PBS 浸潤清洗切片兩次，每次 5 min，用濾紙吸去多余的液體，將處理好的樣品放在濕盒中保持濕潤
陽性處理(僅陽性對照進行此步驟，其他樣品直接進行TUNEL反應步驟)
（1）按1:10的比例用ddH2O將10 × DNase I Buffer稀釋成1 × DNase I Buffer備用。
（2）滴加100 µL 1 × DNase I Buffer到已通透的樣本上，室溫平衡5 min。
（3）用1 × DNase I Buffer 以1:100稀釋DNase I (2 U/μL)，使其為終濃度20 U/mL的工作液。
（4）輕輕吸掉多余液體，加入100 μL濃度為20 U/mL DNase I工作液，室溫孵育10 min。
（5）輕輕吸掉多余液體，PBS清洗樣品2次。
2. TUNEL 反應：
（1）每個樣本加入 100 μL TUNEL 平衡緩沖液，孵育 5 min。
（2）預先配制 TUNEL 反應混合液：每個樣本需要已加入1 μL TdT 酶的 50 μL TUNEL 反應緩沖液。
（3）棄去平衡緩沖液，用濾紙小心吸去切片樣本周圍的多余液體，每個樣本加入 50 μL TUNEL 反應混合液。
a.貼壁細胞，用蓋玻片使緩沖液均勻覆蓋樣本。37℃避光孵育 60 min。
b.懸浮細胞，可加入微孔板中，采用微孔板振蕩器進行孵育或每隔 15 min 溫和的震蕩反應管，使之充分反應。37℃避光孵育 60 min。
c.組織樣本，用蓋玻片使緩沖液均勻覆蓋樣本。將樣本平放于濕盒內，37℃恒溫箱孵育2小時，濕盒底部鋪一張含少量水的紙巾保持濕度。37℃避光孵育 2 h。
d.去掉反應液，在1×PBS 的染色缸中浸泡潤洗2次，每次5 min。再使用適量配制于 PBS 中的 0.1% Triton X-100，其中含 5 mg/mL BSA 的緩沖液清洗樣本3 次，每次5 min，以降低背景。
（5）（可選）復染：每個樣本滴加濃度為2 μg/mL 的DAPI染液，避光室溫孵育10 min。染色完后，輕輕去掉染液，并將樣本在1×PBS中浸泡潤洗3次，每次5 min。
（6）（可選）封片：將切片樣本先純水浸沒5 min，再放入70%乙醇浸沒5 min ，再80%乙醇浸沒5 min，90%乙醇浸沒5 min，95%乙醇浸沒5 min，無水乙醇浸沒5 min，后將切片樣本置于染色缸中以新鮮的二甲苯浸泡透明化處理2次，每次5 min（通風廚中操作）。脫水完成后，擦去切片周圍的液體，每個切片樣本滴加50 μL抗熒光淬滅封片液，蓋上蓋玻片，用鑷子的鈍端輕輕敲擊蓋玻片，去除氣泡以使封片*。
（7）用熒光顯微鏡或流式細胞儀觀察、分析，Cy3的激發波長為550nm，發射波長為570nm（凋亡細胞應被標記上明亮的紅色熒光，沒有加入TdT 酶的陰性對照樣本未被標記上熒光）。
注意事項
1.該產品*于科學實驗研究使用，不得用于臨床診斷、治療等領域。
2.熒光染料均存在淬滅問題，保存和使用過程中請盡量注意避光，以減緩熒光淬滅。
3.為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。