EZ Trans一站式慢病毒包裝試劑盒

產(chǎn)品描述

和元李記EZ Trans一站式慢病毒包裝試劑盒（EZ Trans Lentiviral Infection Kit）包含：慢病毒包裝質(zhì)粒、對(duì)照質(zhì)粒、轉(zhuǎn)染試劑（EZ Trans Regent）、慢病毒濃縮液、慢病毒感染增強(qiáng)劑等必要組份，可一站式高效完成病毒包裝到感染細(xì)胞的全部過程。和元李記慢病毒包裝試劑盒（Lentiviral Infection Kit）提供足量、優(yōu)質(zhì)的對(duì)照質(zhì)粒和包裝質(zhì)粒，省去實(shí)驗(yàn)人員抽提質(zhì)粒的工作可快速包裝病毒感染細(xì)胞。

和元李記慢病毒載體表達(dá)系統(tǒng)由pLenti慢病毒載體和Lentiviral Mix質(zhì)粒組成。pLenti慢載體中含有HIV基本元件5’LTR和3’LTR以及WPRE等其他輔助元件，表達(dá)框?yàn)?span>U6-shRNA(NC)-CMV-EGFP-2A-Puro，含綠色熒光和puro真核抗性?？蛻艨梢愿鶕?jù)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康尼槍?duì)plenti載體改造用于啟動(dòng)子、基因功能功能研究，穩(wěn)定株篩選等。Lentiviral Mix能夠表達(dá)病毒包裝需要的各種必需原件，可以兼容第二代和第三代的慢病毒包裝系統(tǒng)。

訂購(gòu)信息

產(chǎn)品組分

運(yùn)輸與保存

藍(lán)冰運(yùn)輸。A、B組分-20℃保存，C、D、E組分4℃保存，有效期12個(gè)月。

使用方法

一、慢病毒包裝及純化濃縮（以10 cm培養(yǎng)皿為例，1皿為1T）

1.        細(xì)胞準(zhǔn)備：293T細(xì)胞按照6×10⁵cells/mL的細(xì)胞密度傳代到10cm培養(yǎng)皿中，第二天細(xì)胞長(zhǎng)到80%-85%時(shí)準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染。

2.        轉(zhuǎn)染前換液：轉(zhuǎn)染前1h將需要轉(zhuǎn)染的細(xì)胞更換新鮮的DMEM，10mL/皿。

3.        轉(zhuǎn)染：

(1)       取1.5ml EP管記為質(zhì)粒混合液（管A），加入500uL DMEM，16μL質(zhì)粒DNA（可自行改造）和22μL包裝質(zhì)粒，振蕩混勻；

(2)       另取1.5mL EP管記為轉(zhuǎn)染試劑混合液（管B），加入500uL DMEM，90μL 轉(zhuǎn)染試劑，振蕩混勻。

(3)       再將管B緩慢加入到管A中，輕輕混勻，靜置8min形成復(fù)合物，后將混合液均勻滴加到提前換好液的10cm培養(yǎng)皿中，輕輕混勻，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

4.        轉(zhuǎn)染后換液：轉(zhuǎn)染后6-8h，將培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基吸掉，棄于廢液杯中，然后加入10mL 培養(yǎng)基（含有血清和抗生素）繼續(xù)培養(yǎng)。

5.        病毒收集：轉(zhuǎn)染48h后，吸取上清液于50mL 離心管中，4000rpm離心10min, 4℃，將上清液用0.45um過濾器過濾轉(zhuǎn)移到新的50mL 離心管中。此時(shí)上清液中的病毒顆?？梢灾苯尤z測(cè)滴度或者感染目的細(xì)胞，如果對(duì)病毒的滴度及純度有較高要求，可進(jìn)行后續(xù)操作。

6.        病毒濃縮：每10mL 病毒上清液加入2.5mL EZ慢病毒濃縮液（CAT:AC04L442），混勻，4℃放置2h，4000rpm離心30min，吸棄上清。

7.        檢測(cè)及分裝：包裝好的病毒可以直接檢測(cè)滴度，待用的病毒用EZ病毒保護(hù)液重懸分裝凍存。

二、慢病毒感染細(xì)胞（以293T細(xì)胞為例，MOI值為1）

1.         細(xì)胞鋪板：

(1)       將293T細(xì)胞配成5×10⁴cells/mL細(xì)胞懸液，待鋪板。

(2)       將上述細(xì)胞懸液接種到6孔板，每孔鋪2mL，即1×10⁵cells/well。

2.         感染慢病毒：

(1)       鋪好板細(xì)胞培養(yǎng)12-20h，準(zhǔn)備感染。

(2)       加病毒，計(jì)算方法：(細(xì)胞數(shù)×MOI值/病毒原液滴度)×10³=病毒量(μL)，加病毒量見下表。

(3)       加感染增強(qiáng)劑：每孔加10μL 1mg/mL 感染增強(qiáng)劑，最終在細(xì)胞樣品中感染增強(qiáng)劑的終濃度為5μg/mL，輕搖是增強(qiáng)劑分散均勻。

(4)       換液：感染12-20h棄去培養(yǎng)基，每孔加入2mL 新鮮培養(yǎng)基。

3.         觀察：72h后觀察細(xì)胞狀態(tài)，根據(jù)情況做開展后續(xù)實(shí)驗(yàn)。（可選）

注意事項(xiàng)

1.         本產(chǎn)品僅限于科學(xué)實(shí)驗(yàn)研究使用，不得用于臨床診斷、治療等領(lǐng)域。

2.         所有慢病毒操作均應(yīng)盡量在BSL2*生物安全柜中進(jìn)行，并佩戴一次性*口罩和手套。

3.         病毒切忌反復(fù)凍融，凍融一次病毒滴度降低10%-20%左右。

4.         病毒儲(chǔ)存6個(gè)月后，建議在使用前重新測(cè)定病毒滴度。

5.         若MOI值高于20時(shí)，建議感染增強(qiáng)劑使用體積為8μL/mL，提高轉(zhuǎn)染效率，一些特殊細(xì)胞不能加入感染增強(qiáng)劑。

6.         病毒添加量與待感染細(xì)胞MOI值、病毒滴度、目的基因產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞毒性有關(guān)，病毒添加量計(jì)算方法滿足大多數(shù)實(shí)驗(yàn)需要，實(shí)驗(yàn)人員可在此基礎(chǔ)上摸索最佳病毒添加量。

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