蛋白修飾位點分析實驗原理

先通過IP得到目的蛋白，再通過SDS-PAGE對目的蛋白進行分離純化，將膠條上目的蛋白對應的條帶切下進行膠內酶解和高靈敏度的液質聯(lián)用分析(LC-MS/MS)，通過數(shù)據(jù)庫檢索得到蛋白上的修飾位點。

蛋白分析的應用

1. 磷酸化：信號轉導、細胞周期、生長發(fā)育及癌癥機理等；

2.糖基化：蛋白質折疊、更新以及免疫應答等；

3.乙酰化：基因表達調控、細胞凋亡、細胞代謝、蛋白質穩(wěn)定性以及神經(jīng)退行性病變等；

4.泛素化：細胞周期、細胞凋亡、轉錄調控、DNA修復以及信號轉導等；

5.甲基化：染色質結構及轉錄調控等；

6.丙酰化 / 丙二酰化 / 戊二酰化 / 琥珀酰化：主要存在于線粒體和細菌中，與代謝過程密切相關。

實驗流程

1.IP溶液/膠條；

2.蛋白酶消化；

3.LC-MS/MS分析；

4.搜庫后分析，蛋白鑒定、翻譯后修飾分析。

實驗完成周期及交付標準

1. 周期：6周左右

2. 交付標準：質譜原始數(shù)據(jù)、白鑒定列表、肽段信息表、實驗報告（主要儀器、試劑和實驗方法）

需確認的信息

1. 樣品：如果樣品為蛋白質溶液，蛋白質總量≥300mg; 如果是組織樣品，樣品總量≥0.1g； 如果是細胞樣品，細胞數(shù)量≥107個；如果是體液樣品，血清≥200ml，腦脊液≥200ml，尿液≥1ml，淚液≥1ml；

2. 樣品采集過程中使用到塑料制品時，盡量使用無色進口產(chǎn)品，以減少塑料制品中雜質對質譜檢測的影響；

3. 確認樣品所屬種屬、分析需求。