一、稀釋PCR陽性對照（以10E2-10E7拷貝/μL這6個10倍稀釋度為例） - 注意：由于標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區域進行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產品穩定性和避免擴散傳染性病原，本產品不提供活體樣品做陽性對照，只提供可以直接使用的DNA片段作為陽性對照。
- 標記6個離心管，分別為7，6，5，4，3，2。
- 用帶芯槍頭分別加入45 μL熒光PCR模板稀釋液（用帶芯槍頭，下同）。
- 在7號管中加入5 μL 1×10E8拷貝/μL 的陽性對照，充分震蕩1分鐘，得1×10E7拷貝/μL的陽性對照。放冰上待用。
- 換槍頭，在6號管中加入5 μL 1×10E7拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E6拷貝/μL的陽性對照。放冰上待用。
- 換槍頭，在5號管中加入5 μL 1×10E6拷貝/μL的陽性對照到5號管中，充分震蕩1分鐘，得1×10E5拷貝/μL的陽性對照。放冰上待用。
- 重復上面的操作直到得到6個稀釋度的陽性對照。放冰上待用。
二、樣品DNA的制備 - 如果有N個樣品，必須設置N+2個提取，多出的一個是PC（樣品制備陽性對照），一個是NC（樣品制備陰性對照）。可以用10μL上步制備的PCR陽性對照的第4號（濃度為1×10E4 拷貝/μL，10μL相當于1萬拷貝）或第5號（濃度為1×10E5 拷貝/μL，10μL相當于10萬拷貝）再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣，以此作為PC。另外用水作為NC。如果每次制備需要200μL樣品，則PC和NC的體積也必須是200μL。
- 用自選方法純化樣品的DNA，本試劑盒跟市場上大多數病毒DNA提取試劑盒兼容。也可以選購本公司的一管式病毒DNAout或其升級版柱式病毒DNAout。本試劑盒免費贈送15次一管式病毒DNAout，
三、設置qPCR反應（20 μL體系，在樣品制備室進行） - 如果只做1次重復，則標記N+9個PCR管，其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品，1個用于PCR陰性對照，6個用于PCR陽性對照。如果做2-3次重復，則反應設置數量相應增加2或3倍。
- 在標記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復。樣品管和陰性對照設置完畢后才設置陽性對照，并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好后后加）：
成分 | 樣品管 N+2個 | PCR陰性對照管 | PCR陽性 對照管（2-7管） | 2×qPCR MagicMix （棕色管） | 10 μL | 10 μL | 各10 μL | 馬鼻肺炎病毒PCR 引物混合液（白蓋） | 2 μL | 2 μL | 各2 μL | 自備10×ROX (見注) | 2 μL | 2 μL | 各2 μL | N+2待測樣品DNA模板 | 6 μL | 不加 | 不加 | 第7步所得PCR陽性對照 稀釋液（2-7號） | 不加 | 不加 | 各6μL（2號樣到2號管，3號樣到3號管…） |
注:僅ABI7500、7700和7900儀器需要使用ROX作為對照，其他熒光PCR儀器（如iCycler IQ、MJ Option、MJ Chromo4、MX3000、MX4000、RotorGene 3000、RotorGene 6000和LightCycler480）不需要使用ROX，則用水替代。 - 蓋上蓋子后上機，按下面參數進行PCR（具體PCR參數可以根據儀器不同而自行優化）。
過程 | 溫度 | 時間 | 預變性 | 92℃ | 5分鐘 | PCR反應 （30個循環） | 92℃ | 60 秒 | 56℃ | 60 秒 | 74℃ | 60 秒 |
具體操作按所用儀器推薦的流程進行。本產品中所含的熒光染料在不結合DNA時，大吸收光譜在471 nm，結合DNA時的大吸收光譜在500 nm，大發射光譜在530 nm。信號采集可以設置在復性或延伸步驟。 - 如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的log值為橫軸，以Ct值為縱軸，繪制標準曲線。再以待測樣品的Ct值從標準曲線上推算出樣品DNA濃度的log值，再推算出其濃度。
- 如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對照Ct必須大于或等于40。陽性對照必須有熒光對數增長，有典型擴增曲線，Ct值應該小于或等于30。對待測樣品，如果其Ct大于或等于40則為陰性，如果小于或等于35則為陽性。如果在35-40之間，則重復一次。重復實驗的Ct值如果大于或等于40則為陰性，如果小于40，則為陽性。
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