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肠道类器官是研究肠癌、炎症性肠?。↖BD）及肠道发育的“黄金模型"，其构建核心在于精准调控干细胞微环境。本文将手把手拆解肠道类器官构建流程，并揭秘关键细胞因子的种类、浓度及功能，助你轻松掌握这一前沿技术！
肠道类器官：为何成为研究热点？
肠道类器官能高度模拟肠上皮的隐窝-绒毛结构，保留肠道干细胞的自我更新与分化能力，广泛应用于：
?疾病建模：如克罗恩病、肠癌的分子机制研究
?药物筛?。浩拦酪┪镂?、代谢及毒性
?宿主-微生物互作：研究肠道菌群与上皮相互作用
肠道类器官的“四大要素"
1. 细胞来源
成人肠道隐窝干细胞：从手术或活检样本中分离（需伦理审批）
诱导多能干细胞（iPSCs）：通过定向分化生成肠上皮细胞
2. 核心培养基配方
基础培养基：Advanced DMEM/F12（含GlutaMAX、HEPES）
3. 基质胶选择
Matrigel：常用浓度50-70%，模拟基底膜微环境
替代方案：合成水凝胶（如PEG-based），避免批次差异
4. 培养条件
气体环境：37℃、5% CO?，低氧条件（2-5% O?）可提高干细胞活性
培养基更换：每2-3天更换一次，维持细胞因子浓度稳定
分步构建流程（以成人肠道隐窝为例）
? 样本处理：
取新鲜肠道组织，PBS清洗后剪碎。
使用含EDTA的冷缓冲液震荡（30分钟），释放隐窝单元。
?隐窝分离：
通过70 μm滤网过滤，离心（300g，5分钟）收集隐窝。
?基质胶包埋：
将隐窝与Matrigel混合（密度：200-500隐窝/50 μL胶），点胶于预热的培养板。
?培养基覆盖：
添加含上述细胞因子的完quan培养基（每孔500 μL）。
?动态观察：
第3天：隐窝形成闭合球状结构。
第5-7天：出现典型“出芽"结构（类隐窝和绒毛）。
常见问题与优化技巧
?类器官不生长？
检查Wnt3a活性：Wnt信号不足会导致干细胞分化。
优化基质胶比例：Matrigel浓度过高可能限制营养渗透。
?结构异常？
调整Noggin浓度：BMP抑制不足易导致间质细胞过度生长。
缩短传代周期：建议每7-10天机械破碎传代一次。
?如何提高存活率？
添加Y-27632：尤其在初始培养阶段减少凋亡。
避免频繁震动：培养箱内保持稳定，防止基质胶破裂。
应用场景举例
?肠癌模型：
将CRISPR编辑的致癌基因（如APC突变）导入类器官，模拟肿瘤进展。
?药物毒性测试：
添加化疗药物（如5-FU），通过活细胞成像评估肠上皮损伤。
?肠道感染研究：
共培养沙门氏菌或诺如病毒，观察上皮屏障破坏机制。
