工作原理：

磷酸化 Rb（Ser807/811）檢測原理
磷酸化 Rb（Ser807/811）檢測用于測量在 Ser807/811 位點磷酸化的 Rb。與蛋白質(zhì)印跡法不同，該檢測基于微孔板，不需要凝膠、電泳或轉(zhuǎn)膜。磷酸化 Rb（Ser807/811）檢測使用兩種標記抗體，一種帶有供體熒光團，另一種帶有受體。第一種抗體因其對蛋白質(zhì)上磷酸化基序的特異性結(jié)合而被選擇，第二種抗體因其能夠識別不依賴于其磷酸化狀態(tài)的蛋白質(zhì)的能力而被選擇。蛋白質(zhì)磷酸化使得涉及兩種標記抗體的免疫復(fù)合物形成，這使供體熒光團與受體緊密接近，從而產(chǎn)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）信號。其強度與樣品中存在的磷酸化蛋白的濃度直接成正比，并在無需洗滌的檢測形式下提供了一種評估蛋白質(zhì)磷酸化狀態(tài)的方法。

 磷酸化 Rb（Ser807/811）雙板檢測方案：

雙板方案涉及在 96 孔板中培養(yǎng)細胞，然后進行裂解，接著將裂解物轉(zhuǎn)移到低體積檢測板（HTRF 384-lv 或 96-lv 板）中，之后加入 HTRF 磷酸化 Rb（Ser807/811）檢測試劑。該方案能夠監(jiān)測細胞的活力和融合度。 

磷酸化 Rb（Ser807/811）單板檢測方案：

使用 HTRF 試劑檢測磷酸化 Rb（Ser807/811）可以在一個用于培養(yǎng)、刺激和裂解的單板上進行。無需洗滌步驟。這個為高通量篩選設(shè)計的方案能夠?qū)崿F(xiàn)微型化，同時保持強大的 HTRF 質(zhì)量。 

 檢測驗證：

在 HCT-116 細胞中，CDK4/CDK6 抑制劑帕博西尼（Palbociclib）能有效抑制視網(wǎng)膜母細胞瘤蛋白在 Ser807/811 位點的磷酸化。

HCT-116 細胞以 50 微升的體積接種在 96 孔板中（每孔 50,000 個細胞），使用培養(yǎng)基并在 37°C、5% 二氧化碳的條件下孵育。6 小時后，用不斷增加濃度的帕博西尼（另外添加 50 微升體積）處理細胞 19 小時。

移除培養(yǎng)基后，用 50 微升的補充裂解緩沖液在室溫下輕輕振蕩裂解細胞 30 分鐘，然后將 16 微升的裂解物轉(zhuǎn)移到低體積白色微孔板中，再加入 4 微升預(yù)混的 HTRF 磷酸化 Rb（Ser807/811）或總 Rb 檢測試劑。孵育 4 小時后記錄 HTRF 信號。

用Palbociclib（一種細胞周期蛋白依賴性激酶（Cdk4 和 Cdk6）抑制劑）處理會導(dǎo)致視網(wǎng)膜母細胞瘤蛋白在酸 807/811 位點的磷酸化顯著降低，同時該蛋白的總量也會減少（正如 Liu 等人在 2017 年發(fā)表于《Plos》的文獻中所報道的那樣）。

 在人和小鼠細胞系上對磷酸化 Rb 細胞檢測的驗證：

將 NIH 3T3、C2C12 和 HTC116 細胞以每孔 100,000 個細胞的密度接種在 96 孔板中。在 37°C、5% 二氧化碳的條件下孵育過夜后，移除細胞培養(yǎng)基，并向細胞中加入 50 微升裂解緩沖液。進行裂解步驟，輕輕振蕩 30 分鐘。將 16 微升樣品轉(zhuǎn)移到 384 孔小體積板中，然后加入三種 HTRF Rb 檢測試劑中的每一種各 4 微升。4 小時后記錄信號。

兩種 HTRF 磷酸化檢測方法都與小鼠模型兼容。

 使用人HCT116 細胞的磷酸化 Rb Ser807/811 細胞檢測，將 HTRF 檢測與蛋白質(zhì)印跡法進行比較：

人類 HCT116 細胞在 T175 培養(yǎng)瓶中于 5% 二氧化碳、37°C 下培養(yǎng)。當細胞融合度達到 80% 時，裂解細胞并通過離心收集可溶性上清液。對細胞裂解物進行系列稀釋，將每種稀釋液的 16 微升轉(zhuǎn)移到 384 孔低體積白色微孔板中，最后加入磷酸化 Ser807/811 Rb 細胞檢測試劑盒試劑。并行比較顯示，HTRF 磷酸化檢測至少比蛋白質(zhì)印跡法靈敏 27 倍。

簡化的通路：

細胞分裂周期中的視網(wǎng)膜母細胞瘤蛋白。

110kDa 的視網(wǎng)膜母細胞瘤蛋白 Rb 屬于口袋蛋白家族，該家族還包括 p107 和 p130。

Rb 起著腫瘤抑制因子的作用，調(diào)節(jié)細胞周期進程。

使該蛋白失活的突變會導(dǎo)致視網(wǎng)膜母細胞瘤癌癥的發(fā)展，在這種情況下，視網(wǎng)膜細胞無法被替換，并受到高水平的致突變紫外線輻射。

在沒有有絲分裂信號的情況下，具有活性的低磷酸化 Rb 結(jié)合并抑制 E2F 轉(zhuǎn)錄因子，而 E2F 轉(zhuǎn)錄因子是進入 S 期所必需的。

通過使 E2F 失活，Rb 將細胞維持在 G1 期，阻止細胞周期的進程。

在有絲分裂信號存在的情況下，Rb 被細胞周期蛋白 D-CDK4/6 和細胞周期蛋白 E-CDK2 依化并失活。這種磷酸化事件誘導(dǎo) E2F 轉(zhuǎn)錄因子的釋放。

最后，E2F 激活諸如細胞周期蛋白、Cdk、胸苷激酶或 PCNA 等基因的轉(zhuǎn)錄，這些基因在 DNA 合成和復(fù)制以及細胞分裂中起著至關(guān)重要的作用。