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工作原理：
磷酸化 STAT3（Tyr705）檢測原理：
磷酸化 STAT3（Tyr705）檢測用于測量在 Tyr705 位點磷酸化的 STAT3。與蛋白質印跡法不同，該檢測基于微孔板，不需要凝膠、電泳或轉膜。磷酸化 STAT3（Tyr705）檢測使用兩種標記抗體：一種帶有供體熒光團，另一種帶有受體。第一種抗體因其對蛋白質上磷酸化基序的特異性結合而被選擇，第二種抗體因其能夠識別不依賴于其磷酸化狀態的蛋白質的能力而被選擇。蛋白質磷酸化使得涉及兩種標記抗體的免疫復合物形成，這使供體熒光團與受體緊密接近，從而產生熒光共振能量轉移（FRET）信號。其強度與樣品中存在的磷酸化蛋白的濃度直接成正比，并在無需洗滌的檢測形式下提供了一種評估蛋白質磷酸化狀態的方法。

磷酸化 STAT3（Tyr705）雙板檢測方案：
雙板方案涉及在 96 孔板中培養細胞，然后進行裂解，接著將裂解物轉移到 384 孔低體積檢測板中，之后加入磷酸化 STAT3（Tyr705）HTRF 檢測試劑。該方案能夠監測細胞的活力和融合度。

磷酸化 STAT3（Tyr705）單板檢測方案：
使用 HTRF 試劑檢測磷酸化 STAT3（Tyr705）可以在一個用于培養、刺激和裂解的單板上進行。無需洗滌步驟。這個為高通量篩選設計的方案能夠實現微型化，同時保持強大的 HTRF 質量。

檢測驗證：
使用磷酸化 STAT3 檢測進行 HTRF 與蛋白質印跡法的比較：
HeLa 細胞在 T175 培養瓶中于 37°C、5% 二氧化碳的條件下培養 2 天。用 5nM 的 IFNα 刺激 15 分鐘。移除細胞培養基，向細胞中加入 3ml 裂解緩沖液，然后孵育 45 分鐘。離心 10 分鐘后收集可溶性上清液。使用等量的裂解物對蛋白質印跡法和 HTRF 進行并行比較。這兩種方法顯示出相當的靈敏度水平：750 個細胞。HTRF 比蛋白質印跡法具有更高的便利性。

在 NIH 3T3 細胞上的 IL6 劑量反應：
小鼠 NIH 3T3 細胞（每孔 100,000 個細胞）在 37°C 下用各種濃度的 IL6 刺激 30 分鐘。經過 30 分鐘的裂解孵育時間后，使用 HTRF 磷酸化 STAT3（Tyr705）細胞檢測試劑盒的雙板檢測方案測量磷酸化的 STAT3。

JAK 抑制劑對 HeLa 細胞的抑制作用：
HeLa 細胞（每孔 100,000 個細胞）在 37°C 下用各種濃度的拮抗劑孵育 1 小時。然后加入激動劑（IFNα）并孵育 30 分鐘。經過 30 分鐘的裂解孵育時間后，使用 HTRF 磷酸化 STAT3（Tyr705）細胞檢測試劑盒的雙板檢測方案測量磷酸化的 STAT3。

用 HTRF 總 STAT3 檢測來檢查 STAT3 的磷酸化狀態：
使用磷酸化 STAT3（Tyr705）和總 STAT3 檢測的雙板檢測方案，用 IFNα 激活 HeLa 細胞（每孔 100,000 個細胞）15 分鐘。獲得的結果顯示在 IFNα 刺激下 STAT3 磷酸化呈劑量反應性增加，而 STAT3 的表達水平保持恒定。

簡化的通路：
STAT3 在細胞因子受體信號通路中的作用：
響應細胞因子和生長因子，STAT3 被受體相關激酶磷酸化，然后形成二聚體轉移到細胞核，在那里它們作為轉錄激活因子起作用。STAT3 響應細胞刺激介導多種基因的表達，因此在許多細胞過程中如細胞生長和凋亡中起著關鍵作用。白細胞介素 6 家族細胞因子與 gp130 受體的結合通過 JAK2 觸發 STAT3 磷酸化。STAT3 也是其他受體如受體酪·激酶（EGFR、cmet.）和 c-src 的靶標。