圖一、高通量LNP篩選技術促進肺靶向新型陽離子脂質的開發流程示意圖

材料與方法

1.1 脂質合成與初步篩選：

研究團隊組合合成了180種陽離子、可降解的脂質（CAD脂質），這些脂質具有不同的化學結構。

使用體外高通量篩選方法，初步評估這些CAD LNP遞送mRNA的潛力。

1.2 Barcode技術應用：

從初步篩選中選出96種有潛力的CAD LNP，用于封裝Barcode DNA和螢火蟲熒光素酶（FLuc）mRNA。

將這些LNP配方合并，通過系統性給藥方式注入小鼠體內。

利用深度測序技術，量化不同器官（心臟、肝臟、脾臟、肺和腎臟）中Barcode DNA的遞送和積累情況。

1.3 候選LNP的進一步評估：

根據深度測序結果，選出前4種在肺部具有最高遞送效率的LNP進行進一步評估。

通過在小鼠體內遞送FLuc mRNA，評估這些LNP在肺部的mRNA遞送效率。

1.4 抗血管生成治療潛力評估：

選定最佳LNP配方（LNP-CAD9），用于遞送CRISPR-Cas9系統和靶向VEGFR2的sgRNA至小鼠肺部。

評估LNP-CAD9在肺腫瘤模型中誘導VEGFR2基因敲除和抑制腫瘤生長的能力。

實驗結果

2.1 高通量篩選：

為了高效地篩選出具有肺部靶向能力的陽離子可降解脂質類似物，研究者們設計了一個基于Barcode DNA的高通量LNP篩選系統。這一系統使得在同一個動物體內能夠同時評估多種納米顆粒，從而極大地提高了篩選效率。

研究者們首先合成了180種陽離子可降解脂質（CAD脂質），并通過體外高通量篩選初步評估了它們的遞送潛力。在這一階段，他們利用螢火蟲熒光素酶（FLuc）編碼的mRNA來研究CAD LNPs的遞送能力。

隨后，從初步篩選出的CAD LNPs中選擇了96種，用于封裝Barcode DNA和FLuc mRNA。將這些LNP制劑混合后，通過系統給藥的方式注入小鼠體內。利用深度測序技術，研究者們能夠量化這些LNPs在各個器官（心臟、肝臟、脾臟、肺部和腎臟）中的積累情況，從而識別出具有肺部靶向能力的CAD脂質候選物。通過體內篩選，發現了21種在體內具有肺部遞送能力的CAD LNP，并進一步通過富集分析確定了LNP配方（LNP-CAD3、LNP-CAD4、LNP-CAD9和LNP-CAD10），這些配方能夠高效地將核酸貨物遞送到肺部。

為了驗證Barcode DNA積累量能否準確反映CAD LNPs的mRNA遞送能力，研究者們選擇了在肝臟中表現最佳的LNP-CAD20進行體內FLuc mRNA遞送實驗。結果表明，該LNP能夠在肝臟中特異性地表達熒光素酶，這支持了高通量Barcode篩選結果的準確性。

2.2 構效關系研究結果：

化學結構與遞送效率的關系：

研究了CAD脂質的化學結構對其遞送效率的影響。通過改變脂質的化學特性（如離子化性質、尾部結構等），發現這些變化對LNP的遞送效率有顯著影響。特定的化學結構特征（如特定的離子化脂質尾部結構）被發現能夠增強LNP對肺部的靶向性。

LNP的物理特性與遞送效率的關系：

研究了LNP的物理特性（如粒徑、表面電荷等）對其遞送效率的影響。通過調整這些物理特性，發現能夠進一步優化LNP的遞送效率。例如，具有均勻固體核心形態的CAD LNP在遞送mRNA時表現出更高的效率。

圖二、不同結構CAD脂質與體外細胞表達的構效關系研究

圖三、Barcode標記的96種不同陽離子LNP與體內器官靶向分布的構效關系研究

2.3 最佳LNP配方的確定：

體內遞送效率：為了驗證這4種LNP配方的mRNA肺部遞送效率，研究人員將含有螢火蟲熒光素酶（FLuc）mRNA的LNP-CAD3、LNP-CAD4、LNP-CAD9和LNP-CAD10以0.1mg/kg的劑量系統注射到C57BL/6J雌性小鼠體內。通過生物發光成像技術確認，這4種CAD LNPs均能夠按預期將mRNA遞送到肺部。

與金標準系統的比較：為了評估LNP-CAD9的遞送潛能，研究人員還制備了一種金標準肺靶向MC3/DOTAP LNP系統，該系統已被FDA批準用于MC3LNP中的mRNA肺部遞送。比較結果顯示，LNP-CAD9在肺部遞送效率方面顯著優于MC3/DOTAP系統

圖四、小鼠肺靶向LNP的優選分子的評價與驗證

2.4 抗血管生成治療潛力：

除了評估CAD LNPs的遞送效率外，研究者們還探索了它們在抗血管生成癌癥治療中的潛在應用。LNP-CAD9遞送Cas9 mRNA和靶向VEGFR2的sgRNA，在4.0 mg/kg的劑量下有效誘導小鼠肺內皮細胞的VEGFR2基因敲除。在肺腫瘤模型中，LNP-CAD9表現出顯著的抗血管生成治療潛力，能夠抑制腫瘤生長，其療效優于金標準的肺趨向性MC3/DOTAP LNP系統。

圖五：CAD9 LNP敲除VEGFR2產生抗血管生產作用治療小鼠肺腫瘤的效果評價

討論

本研究通過高通量篩選技術，成功鑒定了具有肺部靶向性的陽離子、可降解類脂質材料。LNP-CAD9作為其中的杰出者，在抗血管生成癌癥治療中展現出了巨大潛力。高通量篩選技術的運用，不僅加速了LNP的發現過程，還克服了基因治療應用中肺部遞送的障礙。

高通量篩選技術在本研究中的作用主要體現在以下幾個方面：

1.提高了篩選效率：通過自動化設備和先進的檢測方法，高通量篩選技術能夠在短時間內對大量化合物進行快速篩選，從而極大地提高了新藥發現的效率。在本研究中，我們成功篩選了180種化學性質不同的CAD LNP，并確定了多種高效遞送LNP。

2.增強了篩選準確性：高通量篩選技術具有高度的靈敏度和特異性，能夠準確識別出具有潛在生物活性的化合物。在本研究中，我們利用Barcode技術，實現了對LNP體內遞送效率的精確量化，從而確保了篩選結果的準確性。

3.拓展了應用范圍：高通量篩選技術不僅適用于藥物研發領域，還可應用于生物學研究、器官篩查、基因工程等多個方面。在本研究中，我們成功將高通量篩選技術應用于LNP的篩選和優化，為基因治療領域的發展提供了新的思路和方法。

參考文獻：Xue, Lulu, et al. "High-throughput barcoding of nanoparticles identifies cationic, degradable lipid-like materials for mRNA delivery to the lungs in female preclinical models." Nature Communications 15.1 (2024): 1884.