mRNA疫苗的核心是其序列設計。本研究中使用的mRNA序列包含5'非翻譯區（UTR）、編碼5種抗原的序列、GFP報告基因、3'UTR以及聚腺苷酸（PolyA）尾。5'和3'UTR序列對于mRNA的穩定性和翻譯效率至關重要，通常來源于高表達基因的UTR區域，如α-珠蛋白基因。PolyA尾不僅促進有效翻譯，還能增強mRNA的穩定性，可通過DNA模板編碼或在體外轉錄后添加。此外，質粒中還設計了特定的限制酶位點，便于質粒DNA的線性化，為后續的體外轉錄（IVT）做準備。

質粒DNA的準備是mRNA合成的基礎。通過細菌轉化，使用STBL3大腸桿菌細胞放大編碼mRNA模板的質粒DNA。這一過程包括將少量質粒DNA與細菌細胞混合、熱激處理、培養以及篩選單個菌落進行擴增。最終，使用市售的無內毒素質粒DNA分離試劑（如Promega的PureYield Plasmid Maxiprep System）提取質粒DNA，以確保后續實驗的順利進行。

樹突狀細胞（DCs）是專業的抗原呈遞細胞，在啟動免疫反應中發揮關鍵作用。本研究中，通過從6-8周齡小鼠的骨髓中分離細胞，并在GM-CSF的作用下培養分化成BMDCs。這一過程需要精確的細胞操作和培養條件控制，以確保獲得高質量的BMDCs，用于后續的體外實驗。

B16F10黑色素瘤細胞系用于模擬腫瘤環境，評估疫苗的抗腫瘤效果。細胞在DMEM培養基中培養，至少在解凍后3-7天收集，以確保細胞從解凍過程中恢復，保持良好的生長狀態。收集的細胞用于后續的體內移植實驗，以評估疫苗的保護效果。

mRNA的合成是疫苗制備的關鍵步驟。使用線性化的DNA模板進行體外轉錄（IVT），并在反應中加入CleanCap AG和N1-甲基偽尿苷-5'-三磷酸（m1c），以減少mRNA的免疫原性并提高翻譯效率。合成后的mRNA通過Agilent RNA 6000 Nano kit assay進行質量控制，確保mRNA的純度和完整性。此外，通過dot-blot分析檢測IVT RNA樣本中的雙鏈RNA（dsRNA）含量，因為dsRNA可能具有免疫原性，影響疫苗的安全性和有效性。

圖 1 .mRNA 純度和免疫原性的表征

為了評估mRNA的免疫原性，使用THP-1細胞系檢測IVT mRNA封裝在脂質體中的I型干擾素反應。這一檢測不僅有助于評估mRNA本身的免疫原性，還能反映LNP封裝對mRNA免疫原性的影響。通過量化細胞上清中的干擾素水平，可以篩選出免疫原性較低的mRNA構建體，為疫苗的安全性提供保障。

mRNA-LNP的制備是疫苗遞送系統的關鍵環節。將mRNA封裝在LNP中，以保護mRNA免受降解，并促進其通過內吞/吞噬途徑進入細胞。本期文章將繼續分享mRNA-LNP的制備流程，包括含、RNA的水相樣品準備和微流控法包封mRNA-LNP。

LNP的脂質組分是影響其性能的關鍵因素之一。常用的LNP配方包括可電離脂質、磷脂DSPC、膽固醇和穩定劑，其摩爾比為50:10:37.5:2.5。這種配方經過優化，能夠有效地保護mRNA，促進其在細胞內的釋放，并減少免疫原性。

在實際應用中，根據不同的mRNA疫苗或藥物的需求，脂質的摩爾比例和總濃度可能會有所調整。例如，BioNTech的BNT-162b2、Moderna的mRNA-1273以及Alnylam的Onpattro等獲批用于人體的LNP配方，其脂質組分和摩爾比例各有特點，以適應不同的治療目標和遞送需求。

7.3 微流控包封：

7.4 理化數據檢測：

圖 2 .新鮮和冷凍 mRNA-LNPs 的理化及穩定性特性的測定

在B16F10癌細胞系和BMDCs中轉染mRNA疫苗后，使用抗H2-Kb/SIINFEKL-PE偶聯抗體檢測SIINFEKL肽在H2-Kb上的呈遞。這一實驗步驟不僅驗證了mRNA疫苗在細胞內的翻譯和抗原呈遞能力，還作為質量控制的關鍵環節，確保疫苗能夠有效激活免疫系統。

在小鼠模型中，通過尾靜脈注射mRNA-LNP疫苗進行免疫，評估其誘導的抗原特異性CD8+ T細胞反應。使用四聚體肽-MHC-I復合物（tetramers）檢測抗原特異性T細胞，為疫苗的免疫原性提供直接證據。此外，通過腫瘤挑戰模型評估疫苗的抗腫瘤效果，以腫瘤生長作為指標，進一步驗證疫苗的實際應用潛力。

9.1 第 1 - 5 天：給小鼠進行免疫：

1. 通過腹腔注射 0.1ml 20% Ketamine、10% Pentobarbital Sodium混合液（用蒸餾水稀釋）使小鼠麻醉（假設小鼠體重為 25 克，麻醉液的注射量應根據體重和麻醉反應進行調整）。
2. 每只小鼠通過眼眶后注射 125μl 1 倍 PBS 稀釋的 10μg mRNA-LNP 進行免疫。作為陰性對照，用 1 倍 PBS 對小鼠進行免疫（圖 4A）。注意：mRNA-LNP 疫苗可通過其他途徑給藥，如肌肉注射、皮內注射、皮下注射或鼻內注射。不同的給藥途徑會對免疫反應的動態和特性產生不同的影響。
3. 在第 5 天給予加強劑量，即 10μg mRNA-LNP 或 1 倍 PBS 作為陰性對照。

9.2 第 8 天：分離外周血單個核細胞（PBMC）和脾細胞：

圖 4. mRNA-LNP 疫苗接種后抗原特異性 T 細胞的誘導及抗腫瘤免疫反應

本研究詳細介紹了mRNA脂質納米顆粒疫苗的開發流程和小鼠免疫效率分析的實驗方案。從mRNA序列設計到LNP封裝，再到小鼠免疫實驗，每一步都經過精心設計和嚴格的質量控制。通過這一方案，我們能夠開發出具有高效免疫原性和良好安全性的mRNA疫苗，為預防和治療疾病提供新的策略。盡管實驗過程中存在一些局限性，如僅測量IFN-I反應來評估mRNA免疫原性，以及依賴特定抗體來測量抗原呈遞，但通過不斷優化和改進，mRNA疫苗技術有望在未來的醫學領域發揮更大的作用。

參考文獻：[1] Karekar N, Reid Cahn A, Morla-Folch J, Saffon A, Ward RW, Ananthanarayanan A, Teunissen AJP, Bhardwaj N, Vabre. Protocol for the development of mRNA lipid nanoparticle vaccines and analysis of immunization efficiency in mice. STAR Protoc. 2024 Jun 21;5(2):103087. doi: 10.1016/j.xpro.2024.103087.