“本文研究了溶致液晶相納米結構和膽固醇在增強脂質納米粒（LNPs）介導的巨噬細胞mRNA轉染中的作用。通過開發包含可離子化脂質SM-102、輔助脂質單油酸甘油酯（MO）和膽固醇的LNPs，實現了對肺泡巨噬細胞系（MH-S細胞）的mRNA有效遞送。研究利用同步加速器小角X射線散射（SAXS）技術觀察到，在pH值從7降低到4的過程中，LNPs的內部納米結構發生了從反膠束到六邊形再到立方液晶相的有序轉變。膽固醇被確定為提高巨噬細胞mRNA轉染效率的關鍵組分，其有助于納米結構轉變和蛋白冠變化。本文的研究結果突出了脂質納米結構自組裝以及膽固醇在成功實現mRNA向肺巨噬細胞細胞內遞送和轉染中的關鍵作用，為基于細胞的肺病療法中的RNA技術提供了進展。"
圖一、結構示意圖
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研究結果
1.1 LNP納米結構的表征：
本研究通過改變膽固醇的含量，固定其余組分的方式制備LNP，并利用同步加速器小角X射線散射（SAXS）分析，精確地觀察到了LNP納米結構在不同pH條件下的轉變過程。具體而言，在pH值從7降至4的過程中，LNP經歷了從逆微胞相到六方相，再到立方相的轉變。這種轉變揭示了LNP在模擬細胞內酸性環境時的結構適應性，為理解LNP在細胞內的行為提供了關鍵信息。
1.2 膽固醇對LNP納米結構轉變的促進作用：
在較低pH環境下（如模擬成熟內涵體的pH4條件），不含膽固醇的LNP主要呈現二維有序的H2納米結構相。然而，當LNP中含有膽固醇時，能夠觀察到更復雜的納米結構轉變。這種轉變可能與膽固醇在調節LNP穩定性、促進mRNA從LNP中釋放以及增強LNP與細胞膜融合能力方面的作用有關。這一發現為理解膽固醇如何影響LNP介導的mRNA遞送過程提供了新的見解。同時，也強調了在設計高效LNP制劑時考慮膽固醇含量的重要性。
圖三、不同pH、不同膽固醇、不同N/P比例條件下LNP的結構變化
1.3 膽固醇對mRNA轉染效率的影響：
實驗結果顯示，膽固醇的存在對于實現高效的mRNA遞送至關重要。在LNP制劑中加入20mol%的膽固醇，可以顯著提升mRNA的轉染效率，提高幅度達到50%。這一發現強調了膽固醇在優化LNP性能、增強mRNA遞送能力方面的重要作用。為了驗證LNPs在原代巨噬細胞中的轉染效率，實驗采用了從小鼠肺泡灌洗液中分離得到的原代肺泡巨噬細胞以及從人外周血單核細胞分化而來的單核細胞衍生巨噬細胞（MDMs）。通過熒光素酶mRNA作為模型mRNA進行轉染實驗，發現含有20mol%膽固醇的LNPs在原代肺泡巨噬細胞和MDMs中均表現出較高的轉染效率。這一結果進一步證實了膽固醇在增強LNPs介導的巨噬細胞mRNA轉染中的關鍵作用。通過流式細胞術和共聚焦顯微鏡成像技術，觀察了LNPs與MH-S細胞和原代肺泡巨噬細胞的結合與內化過程。結果發現，所有LNPs均與細胞緊密結合，并有效地被細胞內化。特別是在含有20mol%膽固醇的LNPs處理的細胞中，觀察到了更多的LNPs被內化并定位于細胞內。這一結果表明，膽固醇的加入不僅提高了LNPs的轉染效率，還促進了LNPs與細胞的結合與內化過程。
圖四、不同膽固醇含量、不同N/P比對LNP在巨噬細胞中的轉染效率比較
圖五、不同膽固醇含量對LNP在原代巨噬細胞中的轉染效率比較
1.4 膽固醇對LNP表面吸附蛋白的影響：
LNPs在注入體內后，會與生物流體中自然存在的生物分子（如蛋白質）發生強烈的相互作用，形成蛋白質冠。這種蛋白質冠可以顯著改變LNPs的生物響應。膽固醇的存在影響了LNP表面蛋白質冠的組成。具體而言，含有膽固醇的LNPs（如CHL20和CHL40）與不含膽固醇的LNP（CHL0）相比，在蛋白質冠的組成上存在顯著差異。含有膽固醇的LNPs選擇性吸附了某些特定蛋白質，如補體因子H（CFH）和免疫球蛋白G3（IgG3）。補體因子H（CFH）在免疫調節中起著重要作用，能夠抑制補體激活，從而可能減少LNP的免疫原性。免疫球蛋白G3（IgG3）則與Fc受體（FcγRs）相互作用，參與吞噬作用和細胞因子調節，這可能有助于增強LNPs被巨噬細胞的攝取和內化。這些蛋白質在CHL20和CHL40的蛋白質冠中顯著富集，但在CHL0中則相對缺乏。這些差異表明，膽固醇不僅影響LNP表面吸附蛋白質的數量，還影響其種類和功能，從而可能對LNPs的體內行為和遞送效率產生深遠影響。
結論
本研究開發了一種包含可離子化脂質SM-102、輔助脂質MO和膽固醇的LNPs，用于實現mRNA向巨噬細胞的高效遞送。研究結果顯示，LNPs具有pH敏感的溶致液晶相納米結構，膽固醇在提高mRNA轉染效率中起關鍵作用。本研究為基于細胞的肺病療法提供了有前景的RNA技術進展，強調了脂質納米結構自組裝和膽固醇在成功實現mRNA細胞內遞送和轉染中的重要性。未來的研究將進一步探索LNPs在肺病治療中的潛在應用，并優化其組分和結構以提高轉染效率。
參考文獻：Iscaro, Joshua, et al. "Lyotropic liquid crystalline phase nanostructure and cholesterol enhance lipid nanoparticle mediated mRNA transfection in macrophages." Advanced Functional Materials 34.46 (2024): 2405286.
