“信使核糖核酸（mRNA）療法在治療由遺傳突變、慢性感染、藥物和酒精濫用以及嚴重創傷等引起的肝臟疾病方面具有巨大潛力，每年全球有超過200萬人死于這些肝臟疾病。肝臟遺傳代謝疾病特別適合基于mRNA的蛋白質替代療法和基因編輯。然而，廣泛使用的聚乙二醇化（PEGylated）藥物和脂質納米顆粒（LNPs）會引發抗PEG（anti-PEG）抗體，從而在重復給藥時阻礙治療效果。為解決這一問題，研究人員設計、合成并優化了一系列聚合物脂質，以替代目前使用的1,2-二肉豆蔻酰基-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇-2000（DMG-PEG2000），旨在減少anti-PEG antibodies (APAs)反應性，提高重復給藥療效。"
化學設計與合成
研究人員通過原子轉移自由基聚合（ATRP）技術，合成了具有高密度刷狀結構的聚合物脂質（brush-shaped poly(ethylene glycol) methyl ether methacrylate (PEGMA) lipids (BPLs) ）。這些聚合物脂質的參數，包括側鏈長度、聚合度、錨鏈長度和表面結構，可以調節抗PEG抗體結合親和力，并控制LNPs的血液藥代動力學。與廣泛使用的DMG-PEG2000相比，含有刷狀聚合物脂質的LNPs在蛋白質替代療法和基因組編輯模型中產生了更佳的治療效果，為PEG脂質替代品的結構-活性關系提供了新的見解。具體來說，研究人員首先合成了具有不同側鏈長度的DMG-PEGxMA物種（x=1, 2, 3, 5, 9, 19），這些物種共享相同的脂質起始劑DMG和相似的聚合度，但側鏈長度不同。通過動態光散射（DLS）測量發現，隨著側鏈長度的增加，LNPs的尺寸逐漸減小并趨于穩定，當側鏈長度達到5時，尺寸急劇減小并穩定在約120nm，這與DMG-PEG2000相似，適合用于體內研究。冷凍透射電子顯微鏡（cryo-TEM）圖像顯示，BPL LNPs與DMG-PEG2000 LNPs的結構相似，表明BPL LNPs具有良好的穩定性和mRNA封裝效率（>90%），并且具有較低的細胞毒性。
結果與分析
2.1 聚合物化學結構對mRNA遞送效率的影響：
為了確定是否可以使用具有替代化學結構和物理性質的合成聚合物作為DMG-PEG2000在LNPs中的替代品，研究人員設計了一系列具有不同化學結構的聚合物脂質。通過體外和體內實驗發現，大多數聚合物脂質穩定化的LNPs能夠遞送mRNA，但效率不同。在體內遞送中，只有約40%的LNPs能夠實現有效的mRNA遞送。進一步研究發現，側鏈長度較長的BPL LNPs（如DMG-PEG19MA36）在體內mRNA遞送效率方面表現最佳，這可能是因為較長的側鏈提供了更好的水溶性和穩定性，有助于LNPs的形成和mRNA的封裝。具體來說，DMG-PEG19MA36 BPL LNPs在小鼠肝臟中產生了最高的熒光信號和人紅細胞生成素（hEPO）水平，表明其在mRNA遞送方面的更高效性。
圖1. 合成聚合物與脂質融合的納米顆粒實現高效的mRNA遞送。
2.2 聚合物結構與mRNA遞送效率的關系：
通過精確控制聚合物的架構，研究人員考察了側鏈長度、聚合度和錨鏈長度對mRNA遞送效率的影響。結果表明，側鏈長度的增加有助于LNPs的形成和穩定性，且隨著側鏈長度的增加，LNPs的尺寸減小并趨于穩定。聚合度的增加也會提高mRNA遞送效率，但過高的聚合度可能會抑制細胞攝取和mRNA的釋放。錨鏈長度對LNPs的穩定性和mRNA遞送效率也有重要影響，中等長度的錨鏈（如n=10,12）能夠提供適當的疏水相互作用，促進LNPs的穩定性和mRNA的高效遞送。具體來說，DMG-PEG19MAy（y=5, 10, 21, 36, 60, 77）的聚合度研究發現，隨著聚合度的增加，mRNA遞送效能先增加后減少，峰值出現在聚合度為36時。這表明存在一個最佳的聚合度范圍，既能提供足夠的穩定性和遞送效率，又不會過度抑制細胞攝取和mRNA釋放。
圖2：通過合成化學調控聚合物結構及其對mRNA傳遞效率的影響。
2.3 BPL LNPs減少APA結合并延長血液循環時間：
所有BPL LNPs均表現出比DMG-PEG2000 LNPs更少的蛋白吸附，這歸功于其梳狀結構，有助于延長血液循環時間。通過藥代動力學研究發現，BPL LNPs的血液循環時間比線性DMG-PEG2000 LNPs更長，且隨著側鏈長度的增加，循環時間進一步延長。然而，聚合度的增加會導致循環時間減少，這可能與從蘑菇到刷子結構的轉變有關。此外，錨鏈長度也會影響蛋白介導的清除，較長的錨鏈有助于延長LNPs的循環時間。具體來說，BPL LNPs的Flory半徑（RF）值表明其側鏈處于刷子狀態，而聚合物主鏈的RF值則隨著聚合度的增加從蘑菇狀態過渡到刷子狀態。這種結構轉變影響了LNPs表面的蛋白質吸附和抗體結合親和力，從而影響了其血液循環時間和免疫原性。
圖 3. 聚合參數與聚合物狀態對藥代動力學特征及APA結合具有調控作用。
2.4 BPL LNPs在重復給藥方案中的表現：
為了驗證聚合物脂質架構和表面結構對重復給藥療效的影響，研究人員進行了重復給藥實驗。結果顯示，與DMG-PEG2000 LNPs相比，BPL LNPs在重復給藥后能夠維持更穩定的mRNA遞送效率。結構-活性關系研究表明，側鏈長度、聚合度和錨鏈長度都會影響重復給藥的療效。具體來說，側鏈長度較長的BPL LNPs在重復給藥后的遞送效率下降幅度較小，而聚合度較高的BPL LNPs則表現出較大的遞送效率下降。錨鏈長度對重復給藥療效的影響較小，這可能是因為不同的錨鏈長度具有相似的聚合度和側鏈長度。進一步的實驗發現，在重復給藥后，BPL LNPs組的小鼠血清中抗PEG IgG和IgM水平顯著低于DMG-PEG2000 LNPs組，表明BPL LNPs能夠有效減少免疫反應，從而維持其遞送效率。
圖4. 在重復給藥方案的研究中，BPL LNPs 的表現顯著優于 DMG-PEG2000 LNPs。
2.5 BPL LNPs克服APA抑制效應：
為了進一步驗證BPL LNPs在存在APA的情況下是否能夠維持療效，研究人員進行了再挑戰實驗。首先給小鼠注射DMG-PEG2000 LNPs以產生APA，30天后再次注射BPL LNPs或DMG-PEG2000 LNPs。結果顯示，BPL LNPs能夠延長血液循環時間，降低APA水平，并在第二次給藥后表現出更高的mRNA遞送效率。特別是某些BPL LNPs（如DMG-PEG19MA36和DPG-PEG19MA36）在第二次給藥后表現出優于DMG-PEG2000 LNPs的mRNA遞送效率，表明其能夠有效克服APA的抑制效應。具體來說，DMG-PEG19MA36和DPG-PEG19MA36 BPL LNPs在第二次給藥后，肝臟中的熒光信號和hEPO水平顯著高于DMG-PEG2000 LNPs組，表明其在克服APA抑制方面具有顯著優勢。
圖5. BPL LNPs 可有效克服由 DMG-PEG2000 LNPs 引發的 APA 抑制效應。
蛋白質替代療法與基因組編輯
3.1 BPL LNPs在蛋白質替代療法中的應用：
研究人員使用Fah基因敲除（FAH?/?）小鼠模型，比較了BPL LNPs和DMG-PEG2000 LNPs在mRNA基礎的蛋白質替代療法中的效果。首先驗證了BPL LNPs和DMG-PEG2000 LNPs在體外和體內的mRNA遞送能力，結果顯示兩者均能有效表達FAH蛋白。為了模擬臨床場景，研究人員在開始蛋白質替代療法前30天給FAH?/?小鼠注射DMG-PEG2000 LNPs以產生APA。然后，小鼠每三天接受一次LNP治療，持續33天。結果顯示，接受DMG-PEG19MA36 BPL LNPs治療的小鼠存活率顯著提高，FAH蛋白表達水平也顯著高于接受DMG-PEG2000 LNPs治療的小鼠。此外，BPL LNPs治療組的膽紅素水平顯著降低，表明其在改善肝臟功能方面具有更好的效果。具體來說，在治療結束時，100%接受DMG-PEG19MA36 BPL LNPs治療的小鼠存活，而只有37.5%接受DMG-PEG2000 LNPs治療的小鼠存活。西方印跡分析顯示，DMG-PEG19MA36和DPG-PEG19MA36 BPL LNPs治療組的FAH蛋白表達水平顯著高于DMG-PEG2000 LNPs治療組，表明其在蛋白質替代療法中的更高效性。
3.2 BPL LNPs在基因組編輯中的應用：
研究人員進一步研究了BPL LNPs在體內基因組編輯中的遞送能力，以PCSK9基因為靶點，該基因與血液膽固醇水平調節有關。結果顯示，DMG-PEG19MA36和DPG-PEG19MA36 BPL LNPs在肝臟中誘導了更高的插入和缺失（indels）效率，而DMG-PEG2000 LNPs的效率較低。進一步的基因組測序分析表明，BPL LNPs治療組的indels效率是DMG-PEG2000 LNPs治療組的三倍。此外，BPL LNPs治療組的PCSK9蛋白水平在肝臟和血清中均顯著降低，而DMG-PEG2000 LNPs治療組的降低幅度較小。具體來說，DMG-PEG19MA36和DPG-PEG19MA36 BPL LNPs治療組的PCSK9蛋白水平在肝臟中降低了約100%，而在血清中降低了約70%，而DMG-PEG2000 LNPs治療組的PCSK9蛋白水平在肝臟中僅降低了約60%，在血清中降低了約40%。這些結果表明，BPL LNPs在體內基因組編輯中具有更高的效率和更好的治療潛力。
圖6. BPL LNPs 在蛋白質替代療法和基因組編輯應用中展現了良好的治療效果。
結論與展望
本研究表明，聚合物化學結構和架構控制著納米-生物界面，這為開發具有抗污染能力、肝外遞送能力和LNP制劑工程的新型聚合物提供了新的思路。進一步擴展具有抗污染能力的聚合物化學結構，將有助于深入理解LNP相關的免疫反應和疾病特異性細胞效應。研究人員預計，所報道的多功能聚合物脂質將支持穩健和持久的重復給藥方案，并可能在多種療法中找到有意義的應用。未來的研究將集中在進一步優化聚合物脂質的化學結構和架構，以提高其在不同疾病模型中的療效和安全性。同時，研究人員還將探索BPL LNPs在其他疾病治療中的應用潛力，如癌癥、神經退行性疾病等，為這些疾病的治療提供新的策略和方法。
參考文獻：Xiao Y, Lian X, Sun Y, Sung YC, Vaidya A, Chen Z, Gupta A, Chatterjee S, Zheng L, Guerrero E, Wang X, Farbiak L, Yang Y, Diamond MI, Leal C, McDonald JG, Siegwart DJ. High-density brush-shaped polymer lipids reduce anti-PEG antibody binding for repeated administration of mRNA therapeutics. Nat Mater. 2025 Feb 28. doi: 10.1038/s41563-024-02116-3. Epub ahead of print. PMID: 40021827.
