原理
紅細胞裂解液選擇性裂解紅細胞,然后du特的裂解液/β-巰基乙醇迅速裂解白細胞和滅活細胞RNA酶,然后用乙醇調(diào)節(jié)結(jié)合條件后,RNA在高離序鹽狀態(tài)下選擇性吸附于離心柱內(nèi)硅基質(zhì)膜, 再通過一系列快速的漂洗-離心的步驟, 去蛋白液和漂洗液將細胞代謝物,蛋白等雜質(zhì)去除,最后低鹽的RNase free H20將純凈RNA從硅基質(zhì)膜上洗脫。
材料與儀器
鮮血液
抗凝劑 紅細胞裂解液RLB 去蛋白液RW1 乙醇 漂洗液RW
制冰機 離心機 離心管 移液槍 移液管 針頭 注射器 水浴鍋
步驟
一、在適合大小的RNase free離心管中加入1體積(<1.5 ml)加入各種抗凝劑新鮮血液 (顛倒混勻后)和3體積的紅細胞裂解液RLB,顛倒混勻,可輕彈管壁,確保混勻。
二、室溫放置10分鐘(期間應該顛倒輕彈混勻數(shù)次幫助裂解紅細胞)。
如果RNA降解嚴重,可在冰上裂解,但是時間可長一些以充分裂解。
三、12 000 rpm離心20秒,倒棄紅色上清,并小心的盡可能多的吸棄上清(注意不要吸到管底的細胞團),留下完整的管底白細胞團。
離心后在管底應該見到白色的白細胞團,也可能有一些紅細胞殘片和白細胞團在一起,但是如果看到的是大部分的紅色細胞團,說明紅細胞裂解很不充分,應該再加入紅細胞裂解液重懸細胞團后重復步驟二、三。
上清盡可能的吸棄,殘留過多會稀釋裂解液,造成裂解結(jié)合異常,產(chǎn)量純度降低。
四、渦旋或者輕彈管壁將白細胞沉淀wan全松散重懸,加入350 ul(<0.5 ml全血)或者600 ul(0.5-1.5ml全血)裂解液RLT,吹打混勻后用手劇烈振蕩20秒,充分裂解。病人血樣中白細胞數(shù)量可能大幅增加,應該適當減少處理量。或者按照350 ul(<2x106白細胞)或者600 ul(2x106-1x107白細胞)比例加RTL。
五、用帶鈍針頭的一次性 1 ml(配0.9 mm針頭) 注射器抽打裂解物 5-10 次或直到得到滿意勻漿結(jié)果(或者電動勻漿30秒),可以剪切DNA,降低粘稠度和提高產(chǎn)量。
六、較精確估計裂解物體積,加入等體積的70%乙醇(請先檢查是否已加入無水乙醇!),此時可能出現(xiàn)沉淀,但是不影響提取過程,立即吹打混勻,不要離心。
七、立刻將混合物(每次小于700 ul,多可以分兩次加入)加入一個吸附柱RA中,(吸附柱放入收集管中)13 000 rpm離心60秒,棄掉廢液。
八、加700 ul 去蛋白液RW1,室溫放置30秒,12 000rpm 離心30秒,棄掉廢液。
如果DNA殘留明顯,可在加入RW1后室溫放置5分鐘再離心。
九、加入500 ul漂洗液RW(請先檢查是否已加入無水乙醇),12 000 rpm 離心30秒,棄掉廢液。加入500 ul漂洗液RW,重復一遍。
十、將吸附柱RA放回空收集管中,13 000 rpm離心2分鐘,盡量除去漂洗液, 以免漂洗液中殘留乙醇抑制下游反應。
十一、取出吸附柱RA,放入一個RNase free離心管中,根據(jù)預期RNA產(chǎn)量在吸附膜的中間部位加30-50 ul RNase freewater(事先在 70-80℃水浴中加熱效果更好), 室溫放置1分鐘,12 000 rpm 離心1分鐘。
十二、如果提取全血>0.5 ml或者>2x106白細胞,加30-50 ul RNase free water重復步驟十一,合并兩次洗脫液,或者使用第一次的洗脫液加回到吸附柱重復步驟一遍(如果需要RNA濃度高)。
洗脫兩遍的RNA洗脫液濃度高,分兩次洗脫合并洗脫液的RNA產(chǎn)量比前者高15-30%,但是濃度要低,用戶根據(jù)需要選擇。
注意事項
1. 第一次使用前請先在漂洗液RW瓶和70%乙醇瓶中加入zhi定量無水乙醇。
2. 使用前將10X紅細胞裂解液RLB用DEPC處理水稀釋到1X。
3. 操作前在裂解液RLT中加入β-巰基乙醇至終濃度1%,如1 ml RLT 中加入10 ul β-巰基乙醇。此裂解液最好現(xiàn)用現(xiàn)配。配好的RLT 4℃可放置一個月。
常見問題
1. 第一次使用前請先在漂洗液RW瓶和70%乙醇瓶中加入zhi定量無水乙醇。
2. 使用前將10X紅細胞裂解液RLB用DEPC處理水稀釋到1X。
3. 操作前在裂解液RLT中加入β-巰基乙醇至終濃度1%,如1 ml RLT 中加入10 ul β-巰基乙醇。此裂解液最好現(xiàn)用現(xiàn)配。配好的RLT 4℃可放置一個月。
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