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| 供貨周期 | 現(xiàn)貨 | 貨號 | P0101 |
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LabpO Blunt快速連接試劑盒（帶T4 ligase）
產(chǎn)品貨號：P0101
儲存溫度：－20℃儲存，6個月內(nèi)不影響使用效果。
試劑盒組成 | 20次 | 40次 |
pZERO-Blunt Vector(40ng/ul) | 20ul | 40ul |
900bp Control（40ng/ul） | 5ul | 5ul |
2×Quick Ligation Buffer | 100ul | 200ul |
T4 DNA ligase, 5U/ul | 20ul | 40ul |
Forward Sequencing Primer (10µM) | 50ul | 100ul |
Reverse Sequencing Primer (10µM) | 50ul | 100ul |
產(chǎn)品介紹
零背景平末端快速連接試劑盒是一種先進的自sha基因陽性選擇克隆系統(tǒng)，可以高效克隆平末端 PCR 產(chǎn)物和任何具有平末端的DNA片段。該試劑盒對磷酸化或非磷酸化的DNA片段都有效。陽性選擇載體和插入片段連接僅需5分鐘即可獲得超過95%的陽性重組克隆。由具有校正活性的聚合酶（如：Pfu polymerase）擴增的平末端PCR產(chǎn)物可直接連入克隆載體。連接產(chǎn)物可直接轉(zhuǎn)化常用的大腸桿菌菌株。
試劑盒提供一個新穎的自sha基因陽性選擇克隆載體pZERO-Blunt。該載體含有致死的自sha基因（內(nèi)含多克隆位點），當載體與片段連接成功，自sha基因無法正確表達，包含重組子的細胞可以正常生長；當載體與片段連接不成功，載體自連后自sha基因正確表達，包含自連空載體的細胞無法存活，即零背景。這種陽性篩選策略無需藍白斑篩選，極大地加速了克隆篩選進程。
為方便酶切作圖和插入片段基因操作，pZERO-Blunt克隆載體的多克隆位點兩側(cè)各包含一個BglII識別序列。此外，該載體含有T7啟動子，可用于體內(nèi)或體外轉(zhuǎn)錄、插入片段測序等研究。
操作步驟
1.連接反應(yīng)的準備：
平末端PCR產(chǎn)物或者酶切后平末端片段可以通過瓊脂糖凝膠電泳分離回收（使用長波紫外光
下切膠或者可見光透射切膠避免DNA損傷造成連接失敗）。與載體的摩爾比是3:1。
2.連接反應(yīng)：
1) 在一個標準的10ul連接反應(yīng)體系中，加入1ul 40ng pZERO-Blunt載體、X ul PCR產(chǎn)物(在通常狀況下，沒有必要對PCR產(chǎn)物進行精確定量，一般PCR產(chǎn)物與載體的摩爾比優(yōu)化至1:1~10:1就可以得到良好結(jié)果，推薦3:1，見附錄)、5ul 2×Quick ligation Buffer 和0.9ul的T4 DNA Ligase，其余用滅菌水補足。
反應(yīng)按以下體系進行：
2 × Quick Ligation Buffer | 5ul |
pZERO-Blunt載體 | 1ul |
純化后的PCR 產(chǎn)物/或者 1ul 900bp control | Xul |
無菌水 | Yul |
T4 DNA Ligase （5 Weiss Units/ul) | 0.9ul |
總體積 | 10ul |
一般最后加入T4 DNA Ligase。
2)22℃連接5-10分鐘（一般可在PCR儀器完成）。
通常推薦 22℃連接5-10分鐘 ，>3kb 長片段連接可以延長至30分鐘。不推薦超過30分鐘，超過可能降低轉(zhuǎn)化子數(shù)量。
3)冰上冷卻，然后轉(zhuǎn)化或貯存于-20℃。
3.轉(zhuǎn)化：
1)100ul感受態(tài)細胞，置于冰上，*解凍后輕撣幾次將細胞均勻懸浮。
2)加入4－5ul連接液(最多可全部加入，只要連接液體積不超過感受態(tài)細胞體積的1/10)，輕輕混勻。冰上放置30分鐘。
3)42℃水浴熱激90秒。冰上放置2~3 分鐘。
4)加500ulLB 或者SOC 培養(yǎng)基(不含抗生素)，37℃ 150rpm 振蕩培養(yǎng)60分鐘。
5)將200ul細菌涂布在氨芐青mei素(100µg/ml)平板上。
涂布細菌的用量依連接的效率及感受態(tài)細胞的感受率而進行適當?shù)恼{(diào)整，如果預(yù)計的克隆較少，可通過離心（4,000rpm，2分鐘）后吸除部分培養(yǎng)液，留下適量的培養(yǎng)基懸浮菌體后取全部或者適量涂布于一個平板中（涂布剩余的菌液可以放4度保存，第2天如果轉(zhuǎn)化菌落數(shù)量少，可將剩余菌液全部涂一個新培養(yǎng)板)。
6)平板在37℃下正向放置 1小時以吸收過多的液體，然后倒置培養(yǎng)過夜。
4.轉(zhuǎn)化子的篩選鑒定：
1) 常規(guī)檢測：將得到的菌落接種1-5ml LB（含有終濃度為100µg/ml的氨芐青mei素）培養(yǎng)基，37℃搖床振蕩培養(yǎng)過夜，保存菌種后提取質(zhì)粒，應(yīng)用PCR或酶切方法鑒定插入片段是否正確。
2) 快速檢測：挑取菌落直接進行PCR檢測（可參見分子克隆第3版本）。
3) 測序鑒定：使用試劑盒自帶引物或者T7啟動子引物測序來確定是否含有目的克隆。
試劑盒自帶測序引物（暨菌落PCR引物）：
forward sequencing primer, 23-mer | 5’-CGACTCACTATAGGGAGAGCGGC-3’ |
reverse sequencing primer, 24-mer | 5’-AAGAACATCGATTTTCCATGGCAG-3’ |
附錄：
如何計算連接反應(yīng)中需要的PCR 產(chǎn)物的量 ?
一般PCR產(chǎn)物與載體的摩爾比優(yōu)化至1:1~10:1（推薦3:1）就可以得到良好結(jié)果，可采用以下公式：
[加入載體的量（ng）×插入片段大小（kb）÷載體大小（kb）]×插入片段和載體的摩爾比=插入片段的量（ng） 例如：插入片段和載體連接的摩爾比例為3:1，如連接反應(yīng)中加入載體40ng，插入片段大小為500bp，這時應(yīng)加入插入片段的量為[40ng載體×0.5kb插入片段÷2.974kb載體]×3/1=20.2ng。
pZERO-Blunt 載體圖譜:
pZERO-Blunt 載體克隆位點序列:
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