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細胞周期與細胞凋亡檢測試劑盒

產品貨號：C1002-50T

存儲條件：-20°C避光，有效期24個月

產品說明：

細胞周期與細胞凋亡檢測試劑盒(Cell Cycle and Apoptosis Analysis Kit)是一種采用經典的碘化丙啶染色(Propidium Iodide staining)方法進行細胞周期與細胞凋亡分析。

碘化丙啶(Propidium Iodide，簡稱PI)是一種雙鏈DNA的熒光染料。碘化丙啶和雙鏈DNA結合后可以產生熒光，并且熒光強度和雙鏈DNA的含量成正比。細胞內的DNA被碘化丙啶染色后，可以用流式細胞儀對細胞進行DNA含量測定，然后根據DNA含量的分布情況，可以進行細胞周期和細胞凋亡分析。

碘化丙啶染色后，假設G0/G1期細胞的熒光強度為1，那么含有雙份基因組DNA的G2/M期細胞的熒光強度的理論值為2，正在進行DNA復制的S期細胞的熒光強度為1-2之間。凋亡細胞由于細胞核發生濃縮以及發生DNA片段化(DNA fragmentation)導致部分基因組DNA片段在染色過程中丟失，因此凋亡細胞碘化丙啶染色后呈現明顯的弱染，即熒光強度小于1，在流式檢測的熒光圖上出現所謂的sub-G1峰，即凋亡細胞峰。

細胞發生凋亡時，由于胞漿和染色質濃縮、核碎裂，產生凋亡小體，使細胞的光散射性質發生變化。在細胞凋亡的早期，細胞對前向角光散射的能力顯著降低，對側向光散射的能力增加或沒有變化。在細胞凋亡的晚期，前向和側向光散射的信號均降低。因此可通過流式細胞儀測定細胞光散射的變化觀察細胞凋亡情況。

本試劑盒通常應用于培養的貼壁或懸浮細胞的細胞周期與細胞凋亡檢測。如果用于組織的細胞周期與細胞凋亡檢測，則必須把組織消化成單細胞狀態，才可以進行檢測。

本試劑盒足夠檢測50個樣品，每個樣品的細胞數量可以為10-100萬。

注意事項：

1）本試劑盒需要使用流式細胞儀進行檢測。需自備PBS和70%乙醇。

2）細胞處理需輕柔，盡量避免人為的損傷細胞。

3）為防止不同批次細胞在實驗時所處周期不同導致重復性差，可以在實驗前進行細胞的同步化處理。實驗細胞應處于對數生長期，貼壁細胞一般在50～80%匯合度時收集為宜。

4）400目篩網過濾是用來將粘在一起的細胞團濾掉，留下單細胞，否則會出現人為的多倍體干擾。如果沒有條件過濾，請在染色之前將細胞輕彈以分散，再進行染色。

5）熒光染料均存在淬滅問題，保存和使用過程中請盡量注意避光，以減緩熒光淬滅。

6）碘化丙啶對人體有刺激性，操作碘化丙啶時，應注意防護，保護眼睛、避免吸入。

7）為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

產品組成：

使用方法：

1. 細胞樣品的準備：細胞數量控制在1×105~1 × 106個。

a）貼壁細胞：小心吸除細胞培養液，用胰酶消化細胞，制備成單細胞懸液。1000 g離心5 min，沉淀細胞，棄上清，用1 mL預冷的PBS潤洗細胞一次，離心收集細胞。

b）懸浮細胞：1000 g離心5 min，沉淀細胞，小心吸除上清。加入1 mL預冷的PBS，重懸細胞，再次離心收集細胞。

c）組織細胞：將組織塊用剪刀剪成盡量小的小塊后，用0.25%的胰酶消化0.5-1 h，經過200-400目篩網過濾得到單細胞懸液。1000 g離心5 min，沉淀細胞。加入約1 mL預冷的PBS，重懸細胞，再次離心沉淀細胞。如組織難以消化，可加入適量膠原酶。

2. 細胞固定：

細胞沉淀用1 mL預冷的70%乙醇輕輕混勻，4℃固定2 h以上或者過夜。然后1000 g左右離心5 min沉淀細胞后，小心吸除上清，可以殘留約50微升左右的70%乙醇，以避免吸走細胞。

加入1 mL預冷的PBS重懸。然后再次1000g離心5 min沉淀細胞。小心吸除上清，可以殘留約50微升左右的PBS，以避免吸走細胞。輕輕彈擊離心管底以適當分散細胞，避免細胞成團。

3. 碘化丙啶染色液的配制：

對于1個樣品，在0.5 mL染色緩沖液中加入25uL 碘化丙啶儲液和10uL RNase A溶液，混勻待用。其它數量的樣品參考下表，根據待檢測樣品的數量配制適量的碘化丙啶染色液：

注：配制好的碘化丙啶染色液短時間內可以4℃保存，宜當日使用。

4. 染色：

每管細胞樣品中加入0.5毫升碘化丙啶染色液，輕輕混勻重懸細胞沉淀，37℃避光孵育30分鐘，就可以進行流式檢測，流式檢測最hao在5h內完成。

5. 流式檢測和分析：

用流式細胞儀在激發波長488nm波長處檢測紅色熒光，同時檢測光散射情況。采用適當分析軟件進行細胞DNA含量分析和光散射分析。