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NcoI 快速內切酶

產品貨號：F5550S

儲存條件：-20℃                                            

同裂酶：Bsp19I

注：同裂酶對于不同的甲基化修飾可能具有不同敏感性。

產品組成

產品簡介

LabFD™快速內切酶是一系列經過基因工程重組、能夠在5~15分鐘內精確完成DNA切割的高保真限制性內切酶，適用于質粒DNA、PCR產物或基因組DNA等的快速酶切。LabFD™快速內切酶具有如下特點：5~15分鐘內即可完成酶切；共用一種酶切Buffer，大大簡化酶切反應體系；良好的酶活冗余度，輕松應對底物過量或困難模板酶切。此外，LABLEAD去磷酸化、連接試劑在LabFD™酶切Buffer中具有100%活性，支持一管化反應，提升“酶切-修飾-連接"的體驗。

建議反應條件

1×LabFD™緩沖液；

37℃溫育；

參照“DNA快速酶切流程"配制反應體系。

失活條件

80℃溫育 20 min。

質量控制

功能活性檢測

最適反應溫度下，在20ul反應體系中，1ul LabFD™ NcoI能夠在15min內wanquan消化1ugλDNA。

超長時間溫育檢測

最適反應溫度下，將1ul LabFD™  NcoI與1ugλDNA共同溫育3h，未檢測到其他核酸酶污染或星號活性引起的底物非特異性降解，延時酶切可能出現(xiàn)星號活性。

酶切-連接-再酶切檢測

最適反應溫度下，使用1ul LabFD™  NcoI消化底物，回收酶切產物。在22℃下使用適量Fast T4 DNA Ligase可以將酶切產物重新連接。將連接產物再次回收后，使用相同的內切酶可以重新切開連接產物。

非特異性內切酶活性檢測

最適反應溫度下，將1ul LabFD™  NcoI與1ug超螺旋質粒DNA共同溫育4h，使用瓊脂糖凝膠電泳檢測，質粒DNA仍然處于超螺旋狀態(tài)。

藍白斑檢測

將含有單一lacZα基因的載體以1ul LabFD™  NcoI消化，重新連接后轉化入大腸桿菌感受態(tài)細胞，涂布在含有對應抗生素、IPTG和X-gal的LB培養(yǎng)基平板上。連接正確的產物會生長出藍色菌落，而連接錯誤（即DNA末端切口不完整）的產物將得到白色菌落。對于LabFD™系列限制酶而言，白色菌落比例應小于1%。

使用方法

1.DNA快速酶切流程

1）在冰上按如下建議的加樣順序配制反應體系：

注：本體系適用于經過純化的PCR產物酶切，未純化的PCR具備一定的離子強度，10xLabFD^TMbuffer加入量可適當減少至2ul。但由于DNA聚合酶同時具有外切酶活性，會影響酶切產物，因此如下一步需進行克隆等操作，建議酶切前對PCR產物進行純化。

2）輕柔吸打或輕彈管壁以混勻（切勿渦旋），然后瞬時離心以收集掛壁液滴；

3）37℃溫育15min（質粒），或15~30min（PCR產物），或30~60min（基因組DNA）；

4）80℃溫育 20 min即可使酶失活，停止反應。

2.雙酶切或多酶切

1）每種快速內切酶的用量為1ul，并根據(jù)需要適當擴大反應體系；

2）所有快速內切酶的體積總和不得超過總反應體系的1/10；

3）如果所用的幾種快速內切酶的最適反應溫度不同，應先以最適溫度低的酶開始酶切，再添加最適溫度較高的酶，在其最適反應溫度下進行酶切反應。

3.適用于質粒的擴大反應體系

注：如果總反應體系大于20ul，應適當增加溫育時間，盡量使用水浴、金屬浴或沙浴。

不同DNA中的酶切位點數(shù)量

甲基化修飾影響

在不同反應緩沖液中的活性

注：活性數(shù)據(jù)來自LABLEAD限制酶標準反應體系下的檢測。