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貨號：F0202A
存儲條件：-20°C
產品組分：
組分 | 規格 |
RTase III Primer Flexible All-in-One Mix | 400 μl |
Oligo(dT)20VN (50 μM) | 100 μl |
Random hexamers (50 μM) | 100 μl |
dsDNase | 2x 50ul |
10× dsDNase Buffer | 200ul |
Nuclease-Free Water | 2×1 ml |
產品簡介
反轉錄試劑盒獨立引物（Primer Flexible）是一款高效、便減少污染的高質量一鏈cDNA合成預混液， 包含M-MLV GIII Reverse Transcriptase及其反應 Buffer、RNA 酶抑制劑、dNTPs等一鏈 cDNA 合成所需的多種組分，還需加入RNA 模板、引物和水即可開始反應，操作非常方便。針對不同實驗設計可靈活使用不同類型的逆轉錄引物，滿足多樣化的實驗需求，可根據不同實驗場景選擇Oligo(dT)20VN 或Random hexamers 或 Gene Specific Primers。使用該逆轉錄預混液15分鐘內最長可獲得12 kb大小的cDNA。
從細胞中提取的 RNA 往往存在基因組 DNA 污染，如果逆轉錄前不將其去除，下游 qPCR 反應時基因組 DNA 與 cDNA 會同時被擴增（尤其當引物設計在同一外顯子上時），從而影響基因表達定量準確性。本試劑盒采用 dsDNase 高效去除基因組 DNA 污染，dsDNase 能夠特異性消化雙鏈 DNA（dsDNA 或 DNA-RNA 雜合鏈中的 DNA 鏈），并且具有熱敏感性，在逆轉錄溫度下即可快速不可逆地失活。與傳統使用 DNase I 去除基因組 DNA 污染的方法相比，dsDNase 無需額外加入 EDTA 進行失活，不僅節省實驗時間，而且降低了對逆轉錄反應的抑制。
使用方法
一、 Total RNA
針對基因組含量低的RNA 樣品(推薦方案)
① 于冰上配制如下反應體系：
試劑 | 使用量 |
模板RNAa | 50ng-1ug |
RTase III Primer Flexible All-in-One Mix | 4 ul |
dsDNase | 1 ul |
10× dsDNase Buffer | 1 ul |
Oligo(dT)20VN (50 μM) | 1 μl |
或 Random hexamers (50 μM) | 1 μl |
或 Gene Speci?c Primers (50 μM) | 0.1 μl |
Nuclease-Free Water | To 20 ul |
a. 推薦采用試劑盒提取的 RNA 作為模板。
② 輕柔吸打混勻， 瞬離；
③ 37℃ 溫育2min， 以去除基因組DNA 污染；
④ 55℃ 溫育15 min;
⑤ 反應結束后， 85℃ 溫育5 min 以終止反應；
⑥ 迅速將獲得的cDNA 置于冰上， 用于后續實驗;或立即保存于-20° C。
針對基因組含量高的RNA 樣品
1.基因組DNA污染去除
① 于冰上配制如下反應體系：
試劑 | 使用量 |
Total RNAa | 50ng-1ug |
dsDNase | 1ul |
10× dsDNase Buffer | 1ul |
Nuclease-Free Water | To 10 ul |
a. 推薦采用試劑盒提取的 RNA 作為模板。
② 輕柔吸打混勻，瞬離；
③ 37℃溫育 2 min，以去除基因組 DNA 污染；
注：若 RNA 中基因組 DNA 污染嚴重，可適當延長 37℃溫育時間至 5 min。
④ 65℃溫育 2 min，使 dsDNase 失活，冰上放置。
2.第一鏈 cDNA 合成
①于冰上配制如下反應體系：
試劑 | 使用量（實驗組） |
“實驗 (1)"反應產物 | 10 μl |
RTase III Primer Flexible All-in-One Mix | 4 μl |
Oligo(dT)20VN (50 μM) | 1 μl |
或 Random hexamers (50 μM) | 1 μl |
或 Gene Speci?c Primers (50 μM) | 0.1 μl |
Nuclease-Free Water | To 20 μl |
② 輕柔吸打混勻，瞬離；
③ 55℃溫育 15 min；
注：若目標 RNA 不含 Poly(A) 結構，可預先25℃溫育 10 min。
④ 反應結束后，85℃溫育 5 min 以終止反應；
將獲得的cDNA 溶液置于冰上，用于后續實驗；或立即保存于 -20℃。
注：1.后續實驗為克隆實驗，若RNA來源于真核生物，只需使用 Oligo (dT) VN 即可，加入 Random hexamers 會降低全長 cDNA 的產量；若 RNA 來源于原核生物，只需使用 Random hexamers 或 Gene Speci?c Primers。
2.后續實驗為qPCR，請同時加入Oligo(dT) VN和Random hexamers以獲得mRNA不同位置逆轉錄效率均一的cDNA。
二、miRNA
1.基因組去除
①于冰上配制如下反應體系：
試劑 | 使用量 |
miRNA | 10 pg~200 ng |
dsDNase | 1ul |
10× dsDNase Buffer | 1ul |
Nuclease-Free Water | To 10 ul |
② 輕柔吸打混勻，瞬離；
③ 37℃溫育 2 min，以去除基因組 DNA 污染；
注：若 RNA 中基因組 DNA 污染嚴重，可適當延長 37℃溫育時間至 5 min。
④65℃溫育 2 min，使 dsDNase 失活，冰上放置。
2.第一鏈 cDNA 合成
①于冰上配制如下反應體系：
試劑 | 使用量（實驗組） |
“實驗 (1)"反應產物 | 10ul |
RTase III Primer Flexible All-in-One Mix | 4 μl |
Stem-loop primer(5 μM)b | 1 μl |
Nuclease-Free Water | To 20 μl |
b. 莖環引物推薦終濃度0.25 μM，可在0.1~0.5 μM范圍內進行調整。
② 輕柔吸打混勻，瞬離；
③ 55℃溫育 15 min；
④ 反應結束后，85℃溫育 5 min，以終止反應；
⑤ 將獲得的 cDNA 溶液置于冰上，用于后續實驗；或立即保存于 -20℃。
miRNA 莖環引物及 qPCR 引物設計
1. Stem-loop RT 引物設計：
基于通用的莖環結構，只需要按照不同的 miRNA 序列修改最末端 6個堿基即可。通用莖環結構序列為：GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGAC；
2.以 miR-1-5p 為例，其序列為：CAUACUUCCUUACAUGCCCAUA，只需在通用莖環序列后加上 miRNA 3' 末端的 6 個堿基的反向互補序列，即GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGAC“TATGGG"；
3. qPCR 上游引物設計：miRNA 序列除去 3' 端 6 個堿基的剩余部分作為上游引物，如 miR-1-5p 的上游引物為 ( 注意把 U 改 為 T)：CATACTTCCTTACATG。檢查引物的 Tm 值，如果 Tm 值較低，則在 5' 端加 GC 使 Tm 值接近 60℃。因此 miR-1-5p 的上游引物可設計為：GCCGCCATACTTCCTTACATG，60.3℃；
4. 下游引物是通用的，序列為GTGCAGGGTCCGAGGT；
5. 引物設計好后，需要通過預試驗檢測引物的特異性。一般需要做熔解曲線來檢測引物的特異性；同時最好將 PCR 產物進行電泳檢測產物是否單一（產物長度很短，需要 3% 以上的瓊脂糖膠）。
注意事項
1.所有試劑使用前請輕輕上下顛倒混勻，盡量避免起泡，并經短暫離心后使用；
2.所用的離心管、槍頭等耗材均需保證 RNase-free；
3.為了防止 RNase 污染，請保持實驗區域潔凈；
4.操作時需穿戴干凈的手套、口罩。
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