目錄:柏萊源（天津）生物科技有限公司>>生物試劑>>試劑盒kit>> HG-CH001CHO 殘留DNA檢測試劑盒
| 供貨周期 | 現貨 | 規格 | 100 Reactions |
|---|---|---|---|
| 應用領域 | 生物產業,制藥/生物制藥 |
貨號：HG-CH001
產品簡介：
CHO 殘留 DNA 檢測試劑盒是用于定量檢測各種生物制品的中間品、半成品和成品中 CHO 宿主細胞, DNA 殘留量的專用試劑盒。本試劑盒利用TaqMan 熒光探針原理，定量檢測樣本中 CHO 殘留 DNA。檢測快速，專一性強，性能可靠，最-低檢測限可以達到fg水平。
試劑盒配套的 CHO DNA 定量參考品，已溯源至國家標準品。
檢測范圍：3 fg/μL ~ 3×105 fg/μL
100 Reactions
| 組分 | 規格 | 存儲條件 |
| CHO DNA定量參考品(30ng/μL) | 50μL×1管 | -20℃ |
| CHO Primer&Probe Mix | 550μL×1管 | |
| 2x qPCR Reaction Buffer | 1.6mL×1管 | |
| DNA稀釋液 | 1.5m×3管 |
◆ ABI PRISM 7500
◆ FQD-96A（博日）
◆ CFX96(Bio-Rad)
◆ Roche Light Cycler 480
實驗前請準備好下列耗材與設備：
◆1.5mL或2mL無菌低吸附離心管
◆ 與PCR儀適配的96孔qPCR板或八聯排管
◆ 1000μL，200μL，10μL無菌低吸附帶濾芯槍頭
◆ 熒光定量PCR儀
◆ 水浴鍋/金屬浴
◆ 離心機
◆ 震蕩器
◆ 各規格移液器（如1000μL，200μL，10μL，2.5μL等）
◆ 磁力架
詳見樣品前處理試劑盒（貨號為HG-CL100）操作說明書。
1. 定量參考品及NCS、NTC的制備
1.1 定量參考品：取出 CHO DNA 定量參考品、DNA 稀釋液置于冰上融化；待完-全融化后，輕微振蕩混勻，瞬時離心；
1.2 取 7 支干凈的 1.5mL 離心管，分別標記為 ST0，ST1，ST2，ST3，ST4，ST5，ST6；
1.3 標準品稀釋過程如下表：
| 標準品代號 | 稀釋體積 | 濃度(fg/μL) |
| ST0 | 10μL CHO DNA定量參考品+90μL DNA稀釋液 | 3×10? |
| ST1 | 10μL STO+90μL DNA稀釋液 | 3×10? |
| ST2 | 10μL ST1+90μL DNA稀釋液 | 3×10? |
| ST3 | 10μL ST2+90μL DNA稀釋液 | 3×103 |
| ST4 | 10μL ST3+90μL DNA稀釋液 | 3×102 |
| ST5 | 10μL ST4+90μL DNA稀釋液 | 3×101 |
| ST6 | 10μL ST5+90μL DNA稀釋液 | 3×100 |
2. q-PCR 反應液的制備和加樣
2.1 根據所需檢測的標準樣品和待測樣品數量（一般做3個復孔），計算所需孔數：
反應孔數 =（6 個濃度梯度的標曲 +2 個陰性對照 NTC 和 NCS + 待測樣品）×3
2.2 根據反應孔數計算本次所需的 qPCR Mix 總量：
qPCR Mix =（反應孔數 +2 或 3）× 20μL（2 或 3 為操作損失量）
2.3 將所需試劑置于冰上融化，輕微振蕩混勻，按表 2 所示配制制 qPCR Mix。
| 組分 | 單孔反應(μL) |
| 2× qPCR buffer | 15 |
| CHO Primer&Probe Mix | 5 |
| 總體積 | 20 |
qPCR Mix 配制表
3. 將所需試劑置于冰上融化，輕微振蕩混勻，按下表所示加樣（總體積30μL）：
| 參考品 | 20μL qPCR Mix +10μL ST1/2/3/4/5/6 |
| 陰性對照 | 20μL qPCR Mix +10μL NTC/NCS |
| 待測樣品 | 20μL qPCR Mix +10μL 待測樣本 |
各反應孔加樣示例
4.實驗需使用qPCR實驗專用的八聯管或者96孔板進行反應，需去除反應體系中的氣泡，并離心將液體離至管底準備反應。
5.反應孔排版示例
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | |
| A | ST1 | ST1 | ST1 | S1 | S1 | S1 | ||||||
| B | ST2 | ST2 | ST2 | S2 | S2 | S2 | ||||||
| C | ST3 | ST3 | ST3 | S3 | S3 | S3 | ||||||
| D | ST4 | ST4 | ST4 | |||||||||
| E | ST5 | ST5 | ST5 | |||||||||
| F | ST6 | ST6 | ST6 | ERC -S1 | ERC -S1 | ERC -S1 | ||||||
| G | NTC | NTC | NTC | ERC -S2 | ERC -S2 | ERC -S2 | ||||||
| H | NCS | NCS | NCS | ERC -S3 | ERC -S3 | ERC -S3 |
96孔板排版示例
（以BIO-RAD公司CFX96 qPCR儀為例。）
1.創建實驗反應程序，設置兩步法反應程序如下表：
| Stage1 | 污染消化 | Reps:1 | 50℃ | 2min |
| Stage2 | 預變性 | Reps:1 | 95℃ | 20s |
| Stage3 | 循環反應 | Reps:40 | 95℃ | 3s |
| 60℃ | 30s |
2.創建實驗反應板，點擊 Select Fluorophores 選擇熒光 FAM；在反應板圖表中，選擇樣品孔，在 Sample Type 中下拉選擇Unknow，勾選熒光 FAM，Target Name 命名為 CHO-DNA；輸入每個樣品的重復次數及 Sample Name。( 備注：如儀器要求設置猝滅基團與參比熒光：猝滅基團為 None，參比熒光為 ROX。)
3.在反應板圖表中，選擇標曲孔，在 Sample Type 中下拉選擇 Standard，勾選熒光 FAM，Target Name 命名為 CHODNA；輸入每個稀釋梯度的重復次數及 Sample Name。分別在 ST1、ST2、ST3、ST4、ST5、ST6 的 Concentration 一欄賦值為3.00E+05、3.00E+04、3.00E+03、3.00E+02、3.00E+01、3.00E+00（單位為 fg/μL）。
4.點擊Run界面“Start Run"按鈕進行PCR測定。
以BIO-RAD公司CFX96 qPCR儀為例
1. 點擊資料分析視窗Quantitation，可讀取標準曲線的斜率（Slope）、截距（Intercept）、擴增效率（Effect）、R2。
2. 在視窗Quantitation Data 中，SQ Mean 一欄可讀取無模板對照NTC、NCS、待測樣本的檢測值，單位為fg/μL。
3. 數據可靠性評估：
• 三個平行孔間Ct值差應小于1.0，Ct值大于35的孔除外；
• 陰性對照 NTC 和 NCS 的 CT 值都應大于標曲最-低濃度的 CT 值或根據實驗室自身驗證結果設定標準；
• 標準曲線線性相關系數R2≥0.98，擴增效率85%~110%之間；
• ERC 回收率在 50%~150% 之間（加標回收率 =ERC/(0.9* 樣品 +0.1*ST3)。
1. 本試劑盒已通過穩定性（凍融等因素）的驗證，無需分裝。
2. 陰性樣品和陽性樣品（參考品和待測樣品等）的配制環境需區分區域，不可在一個區域內操作，配制人員需穿戴整齊，戴好口罩、手套和穿好潔凈服。
3. 注意在不同加樣步驟間及時更換吸頭，避免交叉污染，避免長時開蓋。
4. 試劑盒必須在有效期內使用。
5. 試劑盒內所有組分建議在低溫環境融化后使用。
6. 只有嚴格遵守說明書的操作方法，全部使用本試劑盒配套的試劑才能保證優良檢測效果。
7. 盡量在當天完成樣本前處理純化后立即進行后續qPCR檢測，以保證檢測結果的準確性。
8. 最終的試驗結果與試劑的有效性、操作者的操作方法及試驗環境密切相關。
9. 公司只對試劑盒本身負責，不對因使用該試劑盒所造成的樣本消耗負責，請使用者使用前充分考慮到樣本的可能使用量，預留充足的樣本。
10. 本試劑盒僅供體外研究使用，不用于臨床診斷。
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效期保障：嚴格把控產品質量，確保試劑效期新鮮，保障實驗結果的可靠性。
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