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上海語純生物科技有限公司
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產品簡介
| 供貨周期 | 現貨 | 規格 | 10 ×100ul/100×100ul |
|---|---|---|---|
| 貨號 | CC96403 | 應用領域 | 醫療衛生,化工,生物產業,制藥/生物制藥 |
產品貨號：CC96403
產品規格：10 ×100ul/100×100ul
本產品僅供科學研究或進一步生產使用，不可用于臨床診斷或治療。
產品介紹
Y2HGold Chemically Competent Cell
產品簡介
Y2HGold 菌株是 Clontech 公司開發的 GAL4 系統酵母雙雜實驗用菌株，MATa 型，可直接轉化質粒
或與 MATα 型酵母菌株 Y187 通過 mating 操作進行蛋白互作驗證或篩庫試驗。Transformation marker
為：trp1，leu2，報告基因為： AbAr，HIS3，ADE2，MEL1。Y2HGold-GAL4 酵母雙雜系統需要兩
種質粒配套使用：pGBKT7 和 pGADT7。質粒 pGBKT7 的篩選標志為 TRP1，用于表達 DNA-BD (來
自酵母轉錄因子 GAL4N 端 1 ~ 174 位氨基酸)與目標蛋白 (Bait) 的融合蛋白；質粒 pGADT7 的篩選
標志為 LEU，用于表達 AD(GAL4 C 端 768 ~ 881 位氨基酸)與目標蛋白 (Prey)的融合蛋白。GAL4 系
統原理：一個完整的酵母轉錄因子 GAL4 可分為功能上相互獨立的兩個結構域：位于 N 端 1 ~ 174
位氨基酸區段的 DNA 結合域 (DNA-BD)和位于 C 端 768 ~ 881 位氨基酸區段的轉錄激活域 (AD)。
DNA-BD 能夠識別 GAL4-responsive gene 的上游激活序列 UAS，并與之結合。而 AD 可以啟動 UAS
下游的基因進行轉錄。BD 和 AD 單獨存在不能激活轉錄，但當二者接近時，則呈現完整的 GAL4
活性，使含有 UAS 的啟動子下游基因轉錄表達。正常條件下，BD 不與 AD 結合，將要檢測的蛋白
質分別與 BD 和 AD 融合，形成 bait 融合蛋白 (bait -BD)和 prey 融合 蛋白 (prey-AD)，如果 bait 和
prey 發生相互作用，就會促使 BD 和 AD 的相互接近，形成完整的 GAL4，從而激活報告基因的轉
錄。Y2HGold 有四個報告基因：AbAr，HIS3，ADE2，MEL1，分別由三種不同的啟動子 (G1，G2，
M1) 啟動，這三種啟動子只有 GAL4 識別的 17 bp 核心區相同，其余部分均不同，大大降低了酵母
雙雜假陽性發生的概率。此外新報告基因 AbAr 與以前的營養缺陷報告基因相比具有更低背景的優
點，也可以降低酵母雙雜假陽性發生的概率。Y2HGold 感受態細胞經特殊工藝制作，-80℃可保存
三個月，pGADT7 質粒檢測轉化效率>104cfu/μg DNA。
產品組分
名稱
規格
儲存方式
Y2HGold Competent Cell
100 μl /支
-80℃（3 個月）
pGADT7 (control vector, 10 ng/μl)
10 μl
-80℃（12 個月）
Carrier DNA (10 μg/μl)
100 μl
-20℃（12 個月）
PEG/LiAC
5 ml
4℃（12 個月）
基因型：MATa, trp1-901, leu2-3, 112, ura3-52, his3-200, gal4Δ, gal80Δ, LYS2::GAL1UAS-Gal1TATA-His3,
GAL2UAS- Gal2TATA-Ade2 URA3::MEL1UAS-Mel1TATA AUR1-C MEL1
使用方法：
1. 從-80℃取出 Y2HGold 感受態細胞，置于冰上融化，依次加入預冷的目的質粒 2-5 µg，Carrier
DNA (95-100℃，5 min，快 速冰浴，重復一次) 10 µl，PEG/LiAc 500 µl ，吸打混勻，30℃水浴 30
min (15 min 時翻轉 6 - 8 次混勻)。
32. 42℃水浴 15 min (7.5 min 時翻轉 6 - 8 次混勻)。
3. 5000 rpm 離心 40 s 棄上清，ddH2O 400 µl 重懸，離心 30 s 棄上清。
4. ddH2O 50 µl 重懸，涂板，29℃培養 48 - 96 h。
● 培養基配制
① YPDA (1L): Tryptone 20 g ，Yeast extract 10 g ，0.2% adenine 15 ml 補水到 950 ml，用鹽酸調 pH
到 6.5； Agar 20 g(for plates only) 121℃，15 min 高壓滅菌； 待培養基溫度降到 55℃時，加入已過
濾的 40% 葡萄糖 50 ml。
② SD medium (1L): Yeast Nitrogen base 6.7 g ，葡萄糖 20 g ，Dropout 適量（按說明書） 補水到 1L，
調 pH 至 5.8； Agar 20 g(for plates only) 121℃，15 min 高壓滅菌。
③ 0.2% adenine (1L): Adenine 2 g,，補水到 1 L；溶解后高壓滅菌或 0.22 µm 濾膜過濾除菌。
注意事項
1. 感受態細胞最好在冰上融化。
2. 轉化高濃度的質粒可相應減少最終用于涂板的菌量。
3. 同時轉化 2 - 3 種質粒時可增加質粒的用量。
4. Y2HGold 酵母菌株對高溫敏感，最適生長溫度為 27 - 30℃；高于 31℃，生長速度和轉化效率呈
指數下降。
5. 菌落變粉不是污染，是酵母細胞生長中一個常見現象。當細胞在平板培養幾天后，平板上的
Adenine 被酵母消耗完畢，酵母試圖通過自身代謝途徑合成 Adenine 以供利用，然而，有些菌株的
ADE2 基因被破壞，Adenine 合成途徑受阻；又由于其 ADE4,5,6,7,8 基因均正常，所以造成中間產物
P-ribosylamino imidazole (AIR) 在細胞中積累而使菌落變為粉紅色。
6. 酵母在缺陷培養基中生長速度比 YPDA 培養基慢，培養基中缺陷成分越多，生長越慢，以轉化涂
板為例：涂 YPDA 平板 29℃，48 h 培養可見直徑 1 mm 克隆；涂 SD 單缺平板 29℃，48 - 60 h 培養
可見直徑 1 mm 克隆，涂 SD 雙缺平 板 29℃，60 - 80 h 培養可見直徑 1 mm 克隆，涂 SD 三缺或四缺
平板平板 29℃，80 - 90h 培養可見直徑 1 mm 克隆。
Y2HGold Chemically Competent Cell
