諾博萊德  OverExpressC43(DE3)感受態(tài)細(xì)胞

OverExpressC43(DE3)感受態(tài)細(xì)胞 載體構(gòu)建

產(chǎn)品貨號(hào)：C9928

產(chǎn)品名稱：OverExpressC43(DE3)感受態(tài)細(xì)胞

產(chǎn)品規(guī)格：10*100ul

產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

儲(chǔ)存條件：-70℃

具體產(chǎn)品的參數(shù)以收到產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)的參數(shù)為準(zhǔn)

NobleRyderC9928  OverExpressC43(DE3)感受態(tài)細(xì)胞適用于毒性蛋白的表達(dá)，來(lái)源于 OverExpressC41(DE3)菌株。OverExpress C41(DE3)是通過(guò)毒性蛋白在BL21(DE3)內(nèi)過(guò)表達(dá)篩選實(shí)驗(yàn)得到的基因突變菌株,該菌株的基因突變降低了T7RNA聚合酶的酶活性，下調(diào)毒性蛋白的表達(dá)量使細(xì)胞存活。OverExpressC43(DE3)菌株是通過(guò)另一個(gè)毒性蛋白對(duì)OverExpress C41(DE3)菌株再次進(jìn)行毒性耐受性實(shí)驗(yàn)獲得的，OverExpress C43(DE3)菌株比 OverExpress C41(DE3)更加耐受毒性蛋白。OverExpress C43(DE3)菌株也可以表達(dá)常規(guī)蛋白，相同條件 下，蛋白表達(dá)量略低于BL21(DE3)菌株。OverExpressC43(DE3)菌株屬于B菌株，lon和ompT蛋白酶缺陷型。OverExpressC43(DE3) 感受態(tài)細(xì)胞由特殊工藝制成，pUC19 質(zhì)粒檢測(cè)轉(zhuǎn)化效率可達(dá)1×107cfu/μgDNA。

基因型：F-ompThsdSB(rB-mB-) gal dcm (DE3)

菌株抗性：對(duì)氨芐青mei素，卡那mei素，氯mei素和四環(huán)素敏感。

操作方法：（以下操作均按無(wú)菌條件的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行）

（以氨芐青mei素抗性的 pET 質(zhì)粒為例）

1. 將感受態(tài)細(xì)胞置于冰水浴中化凍。待細(xì)胞剛化凍后，加入1-5μl 含有1-100ng的質(zhì)粒DNA 到細(xì)胞中，用手指bo打管底，輕輕混勻。

2. 冰水浴中放置30分鐘，不要晃動(dòng)。

3. 42℃熱擊60 秒鐘，不要晃動(dòng)。

4. 冰水浴中放置 2 分鐘，不要晃動(dòng)。

5. 加入500μL的室溫的SOC或LB培養(yǎng)基。

6. 置于 37℃搖床中，150-200rpm，復(fù)蘇培養(yǎng)60分鐘。

7. 取50-100μL 菌液涂布在含有氨芐青mie素抗性的 LB 平板上。待液體吸干后，倒置平板 37℃培養(yǎng)12-24 小時(shí)。

（平板劃線分離法：復(fù)蘇培養(yǎng)結(jié)束后，12000rpm 離心30秒鐘，棄掉上清，留 100μL左右的液體，用200μL 吸頭輕輕吹打散菌塊， 取10μL重懸的菌液分多點(diǎn)滴在平板上，傾斜吸頭，用吸頭頭部的側(cè)面將滴在平板上的液體來(lái)回劃線。這個(gè)方法可以獲得更多更大的單克隆菌落。）

注意事項(xiàng)：

1、感受態(tài)細(xì)胞應(yīng)保存在-70℃，不可反復(fù)凍融，否則其轉(zhuǎn)化效率將會(huì)降低。

2、實(shí)驗(yàn)過(guò)程中應(yīng)嚴(yán)格無(wú)菌操作，防止其它DNA或雜菌的污染，避免為以后的篩選、鑒定帶來(lái)影響。

3、轉(zhuǎn)化時(shí)，轉(zhuǎn)化效率與外源DNA的濃度在一定范圍內(nèi)成正比，但當(dāng)加入的外源DNA量過(guò)多或體積過(guò)大反而會(huì)降低轉(zhuǎn)化效率。轉(zhuǎn)化時(shí)DNA體積要小于感受態(tài)細(xì)胞體積的十分之一。

4、轉(zhuǎn)化率的計(jì)算：轉(zhuǎn)化率＝產(chǎn)生菌落的總數(shù)/鋪板DNA總量。

5、為防止轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)不成功，可以保留部分連接產(chǎn)物，以重新轉(zhuǎn)化，將損失降到*低。

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C9928  OverExpressC43(DE3)感受態(tài)細(xì)胞  10*100ul