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產品簡介：

魚腸道弧菌（Vibrio ichthyoenteri）是菌體短小，彎曲成弧形，尾部帶一鞭毛的革蘭氏陰性菌，屬于弧菌科弧菌屬。魚腸道弧菌分離自腸部發生病變壞死的牙鲆。魚腸道弧菌可引起牙鲆、石鰈、大菱鲆等多種海水魚類肝臟、腎腫脹及產生腹水，表現為全身性敗血癥感染。腸道弧菌有時還會與其他弧菌一起引發混合感染, 給魚類養殖業帶來嚴重的經濟損失，因此快速檢測魚腸道弧菌具有重要的意義。為此，本公司以探針法qPCR技術為基礎開發了魚腸道弧菌的檢測試劑盒。

產品特點：

1.即開即用，用戶只需要提供樣品DNA模板。

2.引物和探針經過優化，分析靈敏度高，可以達到100拷貝/反應。

3.提供陽性對照，便于區分假陰性樣品。

4.特異性高，引物是根據魚腸道弧菌DNA高度保守區設計，不會跟其他生物的DNA發生交叉反應。

5.既可用于定性檢測，又可用于定量檢測。定量檢測時線性范圍至少為5個數量級。

6.本產品足夠50次20 μL體系的探針法qPCR反應。

7.魚腸道弧菌探針法熒光PCR試劑盒只能用于科研。

產品參數：

產品規格

50T/盒，可滿足一定規模的檢測需求。

檢測方法

實時熒光PCR，具有快速、準確、靈敏等優點。

試劑盒成分

2×Probe qPCR MasterMix、熒光 PCR 專用模板稀釋液、超純水、魚腸道弧菌 qPCR 引物-探針干粉、魚腸道弧菌qPCR 陽性對照(1E7 拷貝/μL)、使用手冊。

自備試劑

樣品 DNA，超純水，核酸純化試劑盒。

保存和運輸

低溫運輸，-20℃保存，保存期限為 12 個月。

使用方法：

一、稀釋標準曲線樣品（以1E1-1E6拷貝/μL這6個10倍稀釋度為例）由于標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區域進行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產品穩定性和避免擴散傳染性病原，本產品不提供活體樣品做陽性對照，只提供無傳染性的DNA片段作為陽性對照。

1.標記6個離心管，分別為6、5、4、3、2、1。

2.用帶芯槍頭分別加入45 μL熒光PCR專用模板稀釋液，最好用帶芯槍頭，下同）。

3.在6號管中加入5 μL 1E7拷貝/μL 的陽性對照(試劑盒提供)，充分震蕩1分鐘，得1E6拷貝/μL的標準曲線樣品。放冰上待用。

4.換槍頭，在5號管中加入5 μL 1E6拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1E5拷貝/μL的標準曲線樣品。放冰上待用。

5.換槍頭，在4號管中加入5 μL 1E5拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1E4拷貝/μL的標準曲線樣品。放冰上待用。

6.重復上面的操作直到得到6個稀釋度的標準曲線樣品。放冰上待用。

二、樣品DNA的制備

7.如果有N個樣品，最好設置N+2個提取，多出的一個是PC（樣品制備陽性對照），一個是NC（樣品制備陰性對照）。可以用10 μL上步所得第4號稀釋液再加上一定量的水使總體積跟每次樣本制備所要求的起始樣本體積一樣，以此作為PC。另外用水作為NC。

8.用自選方法純化樣品的DNA，本試劑盒跟市場上大多數DNA-提取試劑盒兼容，也可以選購本公司的核酸-提取試劑。

三、Probe qPCR反應（20 μL體系，在樣品制備室進行）

9.如果做定量分析并且只做1次重復，則標記N+9個PCR管，其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品，1個用于PCR陰性對照（用水做模板），6個用于標準曲線。如果做定性分析并且只做1次重復，則標記N+4個PCR管，其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品，1個用于PCR陰性對照（用水做模板），1個用于PCR陽性對照（直接用第6步第4號管的陽性對照稀釋液做模板）。下面只以定量分析為例描述操作步驟。

10.在標記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復。樣品管和陰性對照設置完畢后才設置陽性對照，并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好后最后加）：

成分樣品管

N+2個PCR

陰性對照標準曲線樣品管

（1-6管）

2×Probe qPCR MasterMix各10 μL10 μL各10 μL

魚腸道弧菌qPCR      引物-探針混合液各3 μL3 μL各3 μL

 N+2個待測DNA樣本各7 μL不加不加

超純水不加7 μL不加

第6步所得標準曲線

樣品稀釋液（1-6號）不加不加各7 μL（2號樣到2號管，3號樣到3號管…）

11.蓋上蓋子后上機，按下面參數進行qPCR：

過程溫度時間

預變性95℃10 min.

PCR反應

（45個循環）95℃15 sec.

60℃ 30 sec（采集FAM通道的熒光信號，淬滅基團為TAMRA）

四、數據處理

12.如果樣本制備陽性對照或PCR陽性對照(包括標曲樣本)結果為陰性，則整個實驗無效，不需要分析數據，需要重新樣本制備，重新進行PCR擴增或跟廠家聯系。如果樣本制備陰性對照或PCR陰性對照結果為陽性，說明環境污染，則整個實驗無效，不需要分析數據，需要跟廠家聯系。

13.如果陰性對照和陽性對照均正常，則實驗有效，可以進入后續分析。

14.如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的log值為橫軸，以Ct值為縱軸，繪制標準曲線。再以待測樣品的Ct值從標準曲線上推算出樣品DNA濃度的log值，再推算出其濃度。

15.如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對照Ct必須沒有讀數，或者大于或等于40。陽性對照必須有熒光對數增長，有典型擴增曲線，Ct值應該小于40。對待測樣品，如果其Ct沒有讀數、大于或等于40則均為陰性，如果小于40則為陽性。

選擇我們的魚腸道弧菌探針法熒光PCR試劑盒，就是選擇精準、高效、可靠的檢測方案，為您的科研實驗保駕護航！