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產品簡介：

李斯特菌屬（Listeriaspp.）屬乳桿菌目李斯特菌科，無芽孢、好氧或兼性厭氧細      菌。在李斯特氏菌屬的七個種中，只有兩種致病菌：Listeriamonocytogenes和Listeria  ivanovii，Listeriamonocytogenes和人類的李斯特氏菌癥相關。它廣泛分布于自然界中，在腐爛的植物、土壤、動物糞便、污水、青貯飼料和水中。病原感染可引起畏寒、發熱、頭痛、肌痛、關節痛、背痛、腹瀉、惡-心、嘔吐等多種癥狀，嚴重的甚至會出現高熱、意識障礙和肢體癱瘓等。李斯特菌屬的傳播影響人類身體健康，因此快速檢測李斯特菌屬具有重要的意義。本產品就是以探針法 qPCR 技術為基礎開發的專門檢測李斯特菌通用的試劑盒。

產品特點：

1.即開即用，用戶只需要提供樣品 DNA 模板。

2.引物和探針經過優化，分析靈敏度高，可以達到 100 拷貝/反應。

3.提供陽性對照，便于區分假陰性樣品。

4.特異性高，引物是根據李斯特菌 DNA 高度保守區設計，不會跟其他生物的 DNA 發生交叉反應，能檢測本屬的主要物種，包括L.monocytogenes、L.ivanovii、L.  innocua、L.seeligeri、L.welshimeri、L.grayi、L.murrayi。

5.既可用于定性檢測，又可用于定量檢測。用于定量檢測時線性范圍至少為 5 個數量級。

6.本產品足夠 50 次 20 μL 體系的探針法熒光定量 PCR 反應。

7.李斯特菌通用探針法熒光PCR試劑盒只能用于科研。

產品參數：

產品規格

50T/盒，可滿足一定規模的檢測需求。

檢測方法

實時熒光PCR，具有快速、準確、靈敏等優點。

試劑盒成分

2×Probe qPCR MasterMix、熒光 PCR 專用模板稀釋液、超純水、李斯特菌通用 qPCR 引物-探針干粉、李斯特菌通用qPCR 陽性對照(1E7 拷貝/μL)、使用手冊。

自備試劑

樣品 DNA，超純水，核酸純化試劑盒。

保存和運輸

低溫運輸，-20℃保存，保存期限為 24 個月。

使用方法：

一、稀釋標準曲線樣品（以 1E1-1E6 拷貝/μL 這 6 個 10 倍稀釋度為例）。由于標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區域進行，千萬不能污染樣品或本試劑

盒的其他成分）。為增加產品穩定性和避免擴散傳染性病原，本產品不提供活體樣品做陽性對照，只提供無傳染性的 DNA 片段作為陽性對照。

1.標記 6 個離心管，分別為 6、5、4、3、2、1。

2.用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 專用模板稀釋液，最好用帶芯槍頭，下同）。

3.在 6 號管中加入 5 μL 1E7 拷貝/μL 的陽性對照(試劑盒提供)，充分震蕩 1 分鐘，得 1E6 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。

4.換槍頭，在 5 號管中加入 5 μL 1E6 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1E5 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。

5.換槍頭，在 4 號管中加入 5 μL 1E5 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1E4 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。

6.重復上面的操作直到得到 6 個稀釋度的標準曲線樣品。放冰上待用。

二、樣品 DNA 的制備

7.如果有 N 個樣品，最好設置 N+2 個提取，多出的一個是 PC（樣品制備陽性對照），

一個是 NC（樣品制備陰性對照）。可以用 10 μL 上步所得 4 號稀釋液再加上一定量的水使總體積跟核酸制備試劑盒所要求的起始樣本體積一樣，以此作為 PC。另外用水作為 NC。

8.用自選方法純化樣品的 DNA，本試劑盒跟市場上大多數樣品 DNA -提取試劑盒兼容。也可以選購本公司的核酸-提取試劑。

三、Probe qPCR 反應（20 μL 體系，在樣品制備室進行）

9.如果做定量分析并且只做 1 次重復，則標記 N+9 個 PCR 管，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照（用水做模板），6 個用于標準曲線。如果做定性分析并且只做 1 次重復，則標記 N+4 個 PCR 管，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照（用水做模板），1 個用于 PCR 陽性對照（直接用第 6 步第 4 號管的陽性對照稀釋液做模板）。下面只以定量分析為例描述操作步驟。

10.在標記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復。樣品管和陰性對照設置完畢

后才設置陽性對照，并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好后最后加）：

成分樣品管

N+2 個PCR 陰性

對照標準曲線樣品管

（1-6 管）

2×Probe qPCR MasterMix各 10 μL10 μL各 10 μL

李斯特菌通用

qPCR 引物-探針混合液各 3 μL3 μL各 3 μL

N+2 個待測 DNA 樣本各 7 μL不加不加

超純水不加7 μL不加

第 6 步所得標準曲線樣品稀釋液

（1-6 號）

不加

不加各 7 μL（2 號樣

到 2 號管，3 號樣到 3 號管…）

四、數據處理

12.如果樣本制備陽性對照或 PCR 陽性對照(包括標曲樣本)結果為陰性，則整個實驗無效，不需要分析數據，需要重新樣本制備，重新進行 PCR 擴增或跟廠家聯系。如果樣本制備陰性對照或 PCR 陰性對照結果為陽性，說明環境污染，則整個實驗無效， 不需要分析數據，需要跟廠家聯系。

13.如果陰性對照和陽性對照均正常，則實驗有效，可以進入后續分析。

14.如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值為縱軸， 繪制標準曲線。再以待測樣品的 Ct 值從標準曲線上推算出樣品 DNA 濃度的 log 值， 再推算出其濃度。

15.如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對照必須無 Ct 或 Ct 大于或等于 40。陽性對照必須有熒光對數增長，有典型擴增曲線，Ct 值應該小于 40， 否則實驗無效。如果實驗有效，則分析待測樣品，如果無 Ct 或 Ct 大于或等于 40，則為陰性。如果 Ct 小于 40 則為陽性。

選擇我們的李斯特菌通用探針法熒光PCR試劑盒，就是選擇精準、高效、可靠的檢測方案，為您的科研實驗保駕護航！