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產品簡介：

克羅諾桿菌（Cronobacterspp.）是一種食源性致病菌，容易感染新生兒和低體重早產兒并引起壞死性小腸結腸炎、腦膜炎和敗血癥等疾病，致死率高達40%～80%，治愈后可能存在嚴重精神系統后遺癥。由流行病學可知，嬰幼兒感  染克羅諾桿菌與嬰兒配方奶粉的關系十分密切。近年來，克羅諾桿菌污染嬰兒配方奶粉事件頻發并且因其耐藥性給臨床治療帶來巨大挑戰，造成嚴重后果。究其原因，是由于該菌對嬰兒配方奶粉及其加工環境的耐受能力強，不易被完-全消殺從而造成持續污染。因此快速檢測克羅諾桿菌具有重要的意義。本產品就是以探針法 qPCR 技術為基礎開發的專門檢測克羅諾桿菌的試劑盒。

產品特點：

1.即開即用，用戶只需要提供樣品 DNA 模板。

2.引物和探針經過優化，分析靈敏性高，可以達到 100 拷貝/μL。

3.提供陽性對照，便于區分假陰性樣品。

4.特異性高，引物是根據克羅諾桿菌 DNA 高度保守區設計，不會跟其他生物的 DNA 發生交叉反應。

5.既可用于定性檢測，又可用于定量檢測。用于定量檢測時線性范圍至少為 5 個數量級。

6.本產品足夠 50 次 20μL 體系的探針法熒光定量 PCR 反應。

7.克羅諾桿菌探針法熒光PCR試劑盒只能用于科研。

產品參數：

產品規格

50T/盒，可滿足一定規模的檢測需求。

檢測方法

實時熒光PCR，具有快速、準確、靈敏等優點。

試劑盒成分

2×Probe qPCR MasterMix、熒光 PCR 專用模板稀釋液、超純水、克羅諾桿菌 qPCR 引物-探針干粉、克羅諾桿菌 qPCR 陽性對照(1E7 拷貝/μL)、使用手冊。

自備試劑

樣品 DNA，超純水，核酸純化試劑盒。

保存和運輸

低溫運輸，-20℃保存，保存期限為 12 個月。

使用方法：

一、稀釋標準曲線樣品（以 10E1-10E6 拷貝/μL 這 6 個 10 倍稀釋度為例）。由于標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區域進行，千萬不能

污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產品穩定性和避免擴散傳染性病原， 本產品不提供活體樣品做陽性對照，只提供無傳染性的 DNA 片段作為陽性對照。1. 標記 6 個離心管，分別為 6，5，4，3，2，1。

2.用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 專用模板稀釋液，最好用帶芯槍頭，下同）。

3.在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(試劑盒提供)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。

4.換槍頭，在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。

5.換槍頭，在 4 號管中加入 5 μL 1×10E5 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E4 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。

6.重復上面的操作直到得到 6 個稀釋度的標準曲線樣品。放冰上待用。

二、樣品 DNA 的制備

7.如果有 N 個樣品，最好設置 N+2 個提取，多出的一個是 PC（樣品制備陽性

對照），一個是 NC（樣品制備陰性對照）。可以用 10μL 上步所得 4 號稀釋液再加上一定量的水使總體積跟核酸制備試劑盒所要求的起始樣本體積  一樣，以此作為 PC。另外用水作為 NC。

8.用自選方法純化樣品的 DNA，本試劑盒跟市場上大多數樣品 DNA -提取試劑盒兼容。也可以選購本公司的核酸-提取試劑。

三、Probe qPCR 反應（20μL 體系，在樣品制備室進行）

9.如果做定量分析并且只做 1 次重復，則標記 N+9 個 PCR 管，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照（用水做模板），6 個用于標準曲線。如果做定性分析并且只做 1 次重復，則標記 N+4 個 PCR 管，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照（用水做模板），1 個用于 PCR 陽性對照（直接用第 6 步第 4 號管的陽性對照稀釋液做模板）。下面只以定量分析為例描述操作步驟。

10.在標記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復。樣品管和陰性對照設  置完畢后才設置陽性對照，并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好  后最后加）：

成分樣品管

N+2 個PCR 陰性

對照標準曲線樣品管

（1-6 管）

2×Probe qPCR MasterMix各 10 μL10 μL各 10 μL

克羅諾桿菌 qPCR

引物-探針混合液各 3 μL3 μL各 3 μL

N+2 個待測 DNA 樣本各 7 μL不加不加

超純水不加7 μL不加

第 6 步所得標準曲線樣品稀釋液

（1-6 號）

不加

不加各 7μL（2 號樣

到 2 號管，3 號樣到 3 號管…）

五、數據處理

12.如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值為縱軸，繪制標準曲線。再以待測樣品的 Ct 值從標準曲線上推算出樣品DNA 濃度的 log 值，再推算出其濃度。

13.如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對照必須無 Ct 或 Ct 大于或等于 40。陽性對照必須有熒光對數增長，有典型擴增曲線，Ct 值應該小于 40，否則實驗無效。如果實驗有效，則分析待測樣品，如果無

Ct 或 Ct 大于或等于 40，則為陰性。如果 Ct 小于 40 則為陽性。

選擇我們的克羅諾桿菌探針法熒光PCR試劑盒，就是選擇精準、高效、可靠的檢測方案，為您的科研實驗保駕護航！