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產品簡介：

本試劑盒是結合植物葉綠體純化試劑盒和細菌蛋白質提取試劑盒而推出的新興產品，  專門用于植物葉綠體蛋白的快速提取。

產品特點：

1.即用型試劑盒，用戶不需要單獨配制各種溶液。

2.本產品足夠 15 次提取，每次可處理 30g 葉片。

3.得到的提取物可以直接用于 SDS-PAGE、2D 電泳、免疫印跡分析、蛋白活性測定和BCA 法及 Lowry 法蛋白定量（不適用于 Bradford 法）。

4.已經成功用于菠菜、大豆、萵筍、白菜、煙草和甜菜等植物，還可用于更多植物（可  能需要優化條件）。

5.植物葉綠體總蛋白純化試劑盒足夠 15 次葉綠體總蛋白純化。

產品參數：

產品規格

成份編號規格包裝材料

植物葉綠體純化勻漿液成分一250 mL×2250 mL 本色瓶

植物葉綠體純化勻漿液成分二

（干粉）3 g10mL 本色瓶

帶柄尼龍濾膜1 個塑料袋

Percoll60 mL60 mL 本色瓶

植物葉綠體蛋白提取溶液 A15 mL15 mL 本色瓶

植物葉綠體蛋白提取溶液 B1.5 mL1.5mL 本色管

使用手冊1 份無

保存和運輸

常溫運輸和保存, 但植物葉綠體蛋白提取溶液A 和植物葉綠體蛋白提取溶液B 需要-20℃ 保存。保存期限一年。植物葉綠體純化勻漿液成分二（干粉）需要 4℃保存。

自備試劑

去離子水

使用方法：

注意：葉綠體對溫度高度敏感，所以整個操作必須在冰上或者在冷室進行，所用器皿和溶液均需要在 4℃預冷。離心時一定要在 4℃進行，離心力以 g 而不是 rpm 計算。如果需要研究葉綠體的功能，提取還需要在昏暗的光線條件下進行。

一：葉綠體的純化

1.實驗前 1-2 天將植物放在暗室培養以減少葉綠體中淀粉顆粒的形成，否則離心時這些顆粒很容易使葉綠體破裂。葉片在實驗前需先用自來水洗凈，再用蒸餾水淋洗，去掉多余水分。如果葉片采集后不能立即處理，則保存時需要保持葉片濕潤，即使如此，  葉片的放置時間也不能超過一天。

2.新鮮（實驗當天）制備勻漿液：將自備的去離子水與植物葉綠體純化勻漿液成分一按

4：1 的比例混合，然后在混合液中加入植物葉綠體純化勻漿液成分二干粉到終濃度

0.1%（每 100 mL 中加入 0.1g 干粉），搖晃溶解后所得溶液即為葉綠體制備勻漿液，冰上預冷待用。一次實驗（從 30 g 葉片提取葉綠體）所需要的勻漿液體積跟材料不同而不同，可能需要摸索。

3.新鮮采集植物葉片，快速去除葉脈并將葉片剪成 1-3 cm2 大小的碎片并浸泡在適量的預冷的葉綠體制備勻漿液中（每克葉片加 4 mL 葉綠體制備勻漿液，但對煙草和大豆， 每克葉片需要加 6 mL 葉綠體制備勻漿液）。

4.將浸泡了葉片的葉綠體制備勻漿液轉移到Waring 勻漿機（即家用制備果汁的勻漿機）中，低速勻漿 10 秒，避免起泡沫。用玻璃棒把液面的碎片按入勻漿機底部后，再低速勻漿 10 秒。注意：除 Waring 勻漿機外，還可以選擇 Dounce 玻璃勻漿器，Polytron勻漿機和研磨（加玻璃珠）等裂解細胞的方法，但這些方法的單次處理量都比較小， 需分成很多小份單獨勻漿，然后再匯集。

5.用帶柄尼龍濾膜過濾葉綠體制備勻漿液，可先將濾液收集到預冷的 200 mL 量筒中， 再等分到 4 個預冷的 50 mL 的塑料離心管中（每個管中的濾液不要超過 35 mL）。帶柄尼龍濾膜后可反復使用。

6.在水平轉子離心機上 4℃ 200 g 離心 3 分鐘（對菠菜，白菜和萵筍材料）或 400 g 離心 1 分鐘（對甜菜材料），白色沉淀為未破裂的細胞或細胞核。

7.將上清液（含葉綠體）轉移到一個新的、預冷的 50 mL 塑料離心管中。塑料離心管需要提前稱重，以便最后計算制備所得的葉綠體濕重。

8.在水平轉子離心機上 4℃ 1000 g 離心 7 分鐘，小心棄上清，沉淀呈淺綠色，此即為粗提葉綠體。再次稱重，計算出粗提葉綠體濕重?？梢灾苯佑糜诟鞣N后續實驗。

9.如果需要精提葉綠體，則在粗提葉綠體沉淀中加入 1.5 mL 預冷的葉綠體制備勻漿液， 手彈離心管底部使葉綠體重懸。注意：重懸時最好避免溶液起泡，也不要用槍頭吹打，  否則吹打的拉力容易使葉綠體破裂。沉淀底部有白色淀粉屬于正?，F象，但重懸葉綠體時應避免將白色淀粉重懸。將 4 管葉綠體重懸液匯集（共約 6 mL），得到葉綠體粗提液，用密度梯度離心法離心葉綠體粗提液，將其中的完整葉綠體和其中的其他污染物進一步分離。根據植物的不同，可選用下述兩種密度梯度離心法之一進行分離。

10.單密度梯度分離法（適合菠菜，白菜和萵筍等材料）：

a)在 50 mL 塑料離心管中先加入 6 mL 植物葉綠體純化勻漿液和 4 mL Percoll，充分混合均勻。

b)在其液面上小心鋪上第 10 步匯集得到的約 6 mL 葉綠體重懸液。

c)在水平轉子離心機上 4℃ 1700g 離心 6 分鐘，最上層的綠色帶含破碎的葉綠體， 線粒體和核糖體等，管底的綠色沉淀為完整的葉綠體。

d)小心將上清倒出后，在葉綠體沉淀中加入預冷的 0.5 mL 植物葉綠體純化勻漿液成分一（不是植物葉綠體純化勻漿液），手指輕彈管底使之重懸。

e)將葉綠體重懸液轉移到 1.5mL 離心管中并避光保存?？稍谙嗖铒@微鏡下檢查葉綠體完整性。葉綠體必須盡快使用，否則非常容易失去活性。

11.雙密度梯度分離法（適合煙草，甜菜和大豆等材料）：

a)在 14 mL 塑料離心管中先加入 0.5 mL 植物葉綠體純化勻漿液和 2 mL Percoll，充分混合均勻，得密度梯度重液。

b)在另一試管中將 3 mL 植物葉綠體純化勻漿液和 2 mL Percoll 充分混合均勻，得密度梯度輕液。

c)將密度梯度輕液小心鋪在密度梯度重液之上，然后將第 10 步匯集得到的葉綠體重懸液中的 4 mL(還剩下 2 mL)小心鋪在密度梯度輕液之上。

d)在水平轉子離心機上 4℃ 3200 g 離心 15 分鐘，最上層綠色帶含破碎的葉綠體、線粒體和核糖體等，重液和輕液間的綠色帶為完整葉綠體。

e)用廣口吸管小心將重液和輕液之間的綠色帶（葉綠體）轉移到新的離心管中，加入三倍體積的預冷的植物葉綠體純化勻漿液成分一（非植物葉綠體純化勻漿液），   輕柔混勻。

f)在水平轉子離心機上 4℃ 1700 g 離心 1 分鐘，小心將上清倒出后，在綠色的葉綠體沉淀中加入預冷的 0.5 mL 植物葉綠體純化勻漿液成分一（非植物葉綠體純化勻漿液），手指輕彈管底使之葉綠體重懸。

g)將葉綠體重懸液轉移到 1.5 mL 離心管中并避光保存，也可在相差顯微鏡下檢查葉綠體完整性。葉綠體必須盡快使用，否則非常容易失去活性。

12.所得精提葉綠體可用于后續的光合作用，電子鏈和磷酸化，跨膜轉運，體外葉綠體蛋  白合成，蛋白定位等研究。還可用于的葉綠體膜，基質，類囊體，葉綠體 DNA、葉綠體 RNA 和總蛋白純化。

二：葉綠體總蛋

白質的提取

13.按 15 mg 葉綠體濕重加 1 mL 植物葉綠體蛋白提取溶液 A 和 100 uL 植物葉綠體蛋白提取溶液 B 的比例將這兩種溶液加入到粗提葉綠體沉淀（第 8 步）或精提葉綠體沉淀（第 10 步或第 11 步）中，吹打混勻。

14.冰上放置 30 分鐘至 1 小時至溶液變清（葉綠體裂解）。

15. 4℃ 1,2000 g 離心 1 分鐘。

16. 將上清液轉移至一新的1.5 mL 塑料離心管中即得到葉綠體總蛋白溶液，可置于-70℃ 冰箱保存或立即使用。如果要進行 SDS-PAGE 電泳，可取部分樣品到離心管中，加入 5×SDS-PAGE 上樣緩沖液或 2×SDS-PAGE 上樣緩沖液使其終濃度為 1×，在沸水中處理 5 分鐘后立即上樣電泳。

選擇我們的植物葉綠體總蛋白純化試劑盒，就是選擇精準、高效、可靠的檢測方案，為您的科研實驗保駕護航！