通過閱讀相關(guān)文獻(xiàn)，了解您實(shí)驗(yàn)需要選擇哪些Marker，以及這些Marker之間的邏輯關(guān)系（圈門的父子關(guān)系，比如T細(xì)胞CD3是“父”，而CD4或者CD8就是“子”）。

對于細(xì)胞質(zhì)或者細(xì)胞核的Marker，需要對細(xì)胞進(jìn)行固定破膜/破核膜。在做胞質(zhì)或胞核Marker染色實(shí)驗(yàn)操作時(shí)，需要先染細(xì)胞表面Marker，再對細(xì)胞進(jìn)行固定破膜，最后對胞內(nèi)或核內(nèi)Marker染色。此時(shí)細(xì)胞表面的Marker盡量避免使用串聯(lián)染料，因?yàn)椤肮潭ā比菀讓Υ?lián)熒光素造成影響。

確認(rèn)Marker表達(dá)位置的同時(shí)，我們還需要了解Marker的表達(dá)量。前面提到過“強(qiáng)弱搭配”，我們需要通過表達(dá)量的強(qiáng)弱，來搭配熒光素的弱強(qiáng)。

通常，根據(jù)待測細(xì)胞類型中，相應(yīng)抗原的表達(dá)量，可以粗略地將抗原分子分為三類：

步驟三，了解實(shí)驗(yàn)所用流式細(xì)胞儀的配置信息，包括：流式細(xì)胞儀的激光器、檢測通道和濾光片等。

上期提到：流式細(xì)胞儀是同時(shí)檢測多種熒光的，這些熒光之間可能存在干擾。我們需要根據(jù)流式細(xì)胞儀的通道，來確認(rèn)有哪些熒光素可以選擇，這樣可以在后期搭配的時(shí)候，盡量避免干擾。如果沒有儀器的通道信息，是無法去確定哪些熒光素可供選擇的。可以說，如果沒有儀器通道信息，配色就是“無源之水，無本之木”。

通過儀器通道信息，確認(rèn)可以選擇哪些熒光素后，我們還需要了解熒光素的信息，確認(rèn)這些熒光素的激發(fā)波長和發(fā)射波長、接收該熒光的濾光片等信息，是否和流式細(xì)胞儀的通道一致。

▲ 常見熒光基團(tuán)信息

強(qiáng)表達(dá)抗原，可以選擇弱熒光素，也可以選擇強(qiáng)熒光素。

如下圖所示，強(qiáng)表達(dá)抗原CD3，選擇弱熒光素FITC或強(qiáng)熒光素APC，對實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響不大。

弱表達(dá)抗原，一定要選擇強(qiáng)熒光素。

如下圖所示，弱表達(dá)的抗原CD25，選擇弱熒光素PerCP，會導(dǎo)致陰陽性細(xì)胞群分不開。如果選擇強(qiáng)熒光素PE，可以看到明顯的陽性細(xì)胞群。

當(dāng)然，有些老師在配色時(shí)，也會遇到一些其他的問題，如：細(xì)胞樣本有自發(fā)熒光、細(xì)胞處理容易出現(xiàn)死細(xì)胞（需要額外增加死活細(xì)胞染料）等。因此，我們需要特別注意，將對應(yīng)通道的熒光檢測信息，預(yù)留給自發(fā)熒光，或者死活染料檢測。

相信在了解了流式配色的基本原則及操作步驟后，大家的實(shí)驗(yàn)也能更加順利地開展啦~

配色是一個(gè)需要多因素考慮的工作，如果您在閱讀完本文后，具體操作時(shí)還是不清楚如何配色，歡迎填寫下面的配色服務(wù)需求表，我們的技術(shù)支持會給您提供專業(yè)的免費(fèi)配色服務(wù)。

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