前  言

目前已有8款CAR-T藥物相繼獲批上市，其中6款獲得美國FDA批準，2款獲得中國NMPA批準。CAR-T療法在B細胞白血病或淋巴瘤患者中的治療效果，改變了抗癌療法，為難治性患者提供了潛在的治療選擇。但是，CAR-T療法的一些瓶頸限制其廣泛應用，如毒副作用嚴重、抗原逃逸、治療持續性、異質性等，特別是在實體瘤中治療效果有限。因此，科研人員還在通過不斷的研究，以使其能夠得到更廣泛的應用。

1 CAR-T療法的局限性

CAR-T療法實現持久緩解的主要有四種限制：

一，CAR-T細胞衰竭。比如有的患者自身T細胞無法成功生產CAR-T細胞，或者生成的CAR-T細胞擴增不充分。有些患者有限的持久性是疾病復發的潛在因素。

第二，抗原調節。如惡性B細胞上CD19或CD22的丟失或下調，造成抗原逃逸，對CAR-T療法產生抗藥性。

第三，CAR-T療法毒性，主要是嚴重的細胞因子釋放綜合征（CRS）和神經毒性。關于CRS的治療是否干預CAR緩解的持久性影響還在研究中。

第四，未知的疾病機制，這是正在進行的研究工作的重點，以優化CAR-T細胞療法的臨床應用。

CAR-T治療持久性的限制因素[1]

2 CAR設計的優化

CAR主要由組成部分：抗原結合域、鉸鏈、跨膜域和細胞內信號域。每部分有不同的功能，組成部件的多樣化組合，可以實現CAR分子的優化設計。抗原結合域常為單鏈抗體（scFv)，負責識別并結合靶抗原。鉸鏈和跨膜域可將scFv錨定于細胞膜上。胞內信號域由共刺激因子和CD3信號域組成。當抗原被識別和結合后，產生刺激信號傳至胞內信號域，T細胞被激活并發揮效應功能。

CAR分子結構[2]

scFv序列通常來源于鼠或人的單克隆抗體。scFv可對CAR功能產生影響，影響CAR對靶抗原的特異性和親和力。

鉸鏈區提供足夠的靈活性來克服空間位阻，影響抗原結合和CAR信號。來自CD8、CD28、IgG1或IgG4的氨基酸序列已被用于CAR鉸鏈結構域。跨膜結構域將CAR錨定在T細胞膜上，通常來源于I型蛋白，如CD3ζ、CD28、CD4或CD8α，影響CAR的穩定性和功能。

胞內信號結構域通常包括激活區、一個或多個共刺激域。絕大多數CAR通過CD3ζ衍生的相關的免疫受體激活CAR-T細胞。共刺激信號對獲得更佳功能及持久性的T細胞是必要的，研究廣泛的共刺激結構域來自CD28或4-1BB（CD137）。

有研究人員設計了一種可互換靶點的通用CAR分子：Supra CAR，由T細胞上表達的通用受體（zipCAR）和腫瘤靶向單鏈抗體適配器（zipFv）組成。zipFv的單鏈抗體與腫瘤抗原結合，通過亮氨酸拉鏈激活T細胞上的zipCAR。具有多種特征有助于對抗復發、緩解過度激活和增強特異性。

可互換靶點的通用CAR分子[3]

3更多解決方案

對于CAR-T治療過程中出現的細胞因子風暴和神經毒性，主要是干預細胞因子的分泌或控制T細胞的過度激活，如通過抗體阻斷IL-1、IL-6和GM-CSF，進而阻斷過度的炎癥反應。面對治療過程中產生抗性的問題，可以通過設計多靶向的CAR分子或增加靶抗原的表達來改善，或是提高scFv與靶抗原的親和力，也可能有助于CAR-T細胞識別低密度的靶抗原。

目前CAR-T的制造多使用患者的異質性T細胞。某些特定T細胞亞群修飾的CAR-T細胞可能會產生更好的效果。制造通用型細胞是未來發展的方向。有一種形式是抗體帶上生物素等標簽，與抗原結合后標記腫瘤細胞，然后針對這個標簽開發的 CAR-T 細胞就會被激活，發揮細胞殺傷功能。

CAR-T細胞研究試驗圍繞療效、毒性和耐藥性展開，以尋找新型靶點、闡明信號機制為基礎，結合新型技術的應用，通過CAR設計、轉導方法和細胞類型的不斷研究，必將提高CAR-T治療效果，并適用于更多類型癌癥患者的治療。

義翹神州CAR-T開發解決方案

作為一家專注于為生物醫藥領域提供關鍵試劑和技術服務的企業，義翹神州特地推出了綜合性的CAR-T細胞療法開發解決方案，支持客戶更方便、更快速地完成從早期靶點發現到臨床前研究的每一個階段。

CAR 開發

scFv候選分子開發：scFv抗體庫構建平臺、Beacon®單B細胞發現平臺、流式單B細胞發現平臺、雜交瘤開發平臺

scFv候選分子篩選：scFv抗體親和力檢測 （SPR/BLI）、檢測用過表達細胞株構建

靶點蛋白：250+ CAR-T熱門靶點蛋白，涵蓋熒光標記、生物素標記和無標記形式，高活性，高批間一致性，更接近于天然蛋白結構。

蛋白表達：哺乳動物瞬時表達、桿狀病毒-昆蟲表達、大腸桿菌蛋白表達、無細胞表達

T 細胞激活

CD3單克隆抗體：GMP-10977-H001

Effect of human CD3 (humanized OKT3) antibody on the proliferation and IFN-gamma secretion of CD4+ T cells.

CD28單克隆抗體：GMP-11524-H001

Effect of human CD28 antibody on stimulating IL-2 secretion of CD4+ T cells co-activated with CD3 antibody.

慢病毒包裝

無血清細胞培養基及補料液

SMM 293-CD1 培養基（貨號：M293CD1）

相同條件下，使用SMM 293-CD1培養基，HEK293F細胞密度更好。

多款現貨無血清、無動物源的HEK293培養基

細胞轉染試劑

義翹神州擁有高品質的轉染試劑 Sinofection® Transfection Reagent（Cat#: STF02），細胞毒性小、重復性高，可用于慢病毒載體的高效轉染，轉染效率基本可以達到95%以上。

GMP級核酸酶

義翹神州提供GMP級條件下生產的全-能核酸酶Super Nuclease（Cat#: GMP-SSNP01），無動物源性，可高效降解單鏈、雙鏈、線性、環狀、超螺旋等任何形式的DNA及RNA。超高活性，應用場景廣泛且使用量低不易殘留，質量、性能、供貨能力可靠，并已完成在FDA的藥物主文件申報備案（DMF Number#:35978），滿足藥物申報的需求。

相同條件下，不同用量的GMP級全-能核酸酶和其他品牌核酸酶對鮭魚精DNA的降解效率相當

細胞庫檢測

義翹神州遵循NMPA、FDA、EMA、ICH等多個國內外法規和指導原則，建立了全面的細胞庫測定方法，助力于CAR-T細胞治療的安全性，主要包括以下幾個檢測方面：無菌檢查、支原體檢查、內外源病毒污染檢查、成瘤性檢查等。

慢病毒包裝質粒生產

義翹神州升級改造后的慢病毒質粒制備平臺，采用GMP級別的生產線，對過程和最終產品的嚴格管控，確保了最終產品質量符合客戶需求。義翹神州可以提供從μg級別，mg級別至g級別不同規模的科研級質粒生產服務，滿足不同的需求。

CAR-T 細胞擴增

更規范的GMP級質量管理體系、文件齊全的質量保證管理體系、更穩定質量控制體系、更安全的產品安全性檢測體系：四大體系造就高品質GMP級細胞因子，保障CAR-T開發！

以GMP-IL21產品為例

高純度：SDS-PAGE和SEC-HPLC高于95%

高批間一致性

高穩定性

CAR-T細胞質量控制

CAR-T細胞純度檢測

CAR-T細胞活性及功能性檢測

ELISA檢測試劑盒

過表達細胞株構建服務

CAR-T細胞安全性檢測

無菌檢查

支原體檢查

細胞內源病毒因子檢查

外源病毒因子檢查

【參考資料】

[1] Nirali and T erry,  Mechanisms of resistance to CAR T cell therapy. Nature reviews | Clinical Oncology

[2] Sarwish, et al.  Engineering strategies to overcome the current roadblocks in CAR T cell therapy. Nature reviews | Clinical Oncology

[3] Rebecca and  Marcela, Recent advances and discoveries in the mechanisms and functions of CAR T cells. Nature reviews | Cancer