HEG1 Protects Against Atherosclerosis by Regulating Stable Flow-Induced KLF2/4 Expression in Endothelial Cells

Keywords: KLF2/4; atherosclerosis; endothelial cells; heart-of-glass 1; mechanobiology.

動脈粥樣硬化優先發生在血流模式紊亂（d-flow）的血管分支和彎曲區域，內皮細胞（ECs）暴露于致動脈粥樣硬化的振蕩、低幅度剪切應力（OSS）。相比之下，暴露于穩定血流模式（s-flow）下的直向、非分支區域的血管提供單向、層流、高幅度的剪切應力（ULS），促進內皮穩態，不會發生動脈粥樣硬化。ECs 響應這些不同的血流模式而發生的促動脈粥樣硬化和抗動脈粥樣硬化變化在很大程度上是由血流敏感基因的轉錄變化介導的。在 s-flow 中調節的基因通常在預防 EC 功能障礙和動脈粥樣硬化中發揮作用，而由 d-flow 調節的基因通常促進 EC 功能障礙和動脈粥樣硬化。

具有EGF樣結構域的心臟發育蛋白1（heart-of-glass homolog 1，HEG1）是一種粘蛋白類膜蛋白，在內皮細胞中富集，在胚胎發育和血管生成中起關鍵作用。研究已將其確定為小鼠動脈 ECs 中的血流敏感基因。盡管HEG1基因敲除在心臟發育和血管形態發生中的作用已被證實，但其在成年動脈EC功能中響應血流和動脈粥樣硬化的作用尚不清楚。

鑒于此，美國佐治亞理工學院和埃默里大學Wallace H. Coulter生物醫學工程系的研究團隊表明，HEG1 由 s-flow 誘導，被 d-flow 降低，并以 KLF2/4（Krüppel 樣因子 2/4）依賴性方式介導 s-flow誘導的內皮功能。研究成果發表于 Circulation 期刊題為“HEG1 Protects Against Atherosclerosis by Regulating Stable Flow-Induced KLF2/4 Expression in Endothelial Cells”。

小鼠PCL手術后結扎左側頸總動脈（LCA）暴露于 d-flow，同時使用繼續暴露于s-flow 的右側頸總動脈（RCA）作為內部對照。scRNA-seq 分析顯示，Heg1 主要在 ECs 和成纖維細胞中表達，且與暴露于 d-flow 的 EC 相比，s-flow 條件下發現的 EC 簇表達 Heg1 水平顯著升高。這表明，EC 中 Heg1 表達具有流量敏感性，s-flow 上調，d-flow 下調Heg1 表達。

為了確認這些體內結果并表征血流對 HEG1 的調節，將 HAECs 暴露于 ULS（15 dyn/cm2，模擬 s-flow）或 OSS （+5/–4 dyn/cm2，1 Hz，模擬 d-flow），靜態條件下的 HAECs用作對照。與 OSS 和靜態條件相比，暴露于 ULS 24 小時顯著增加了 HEG1 mRNA 和蛋白質表達（圖1 A、B）。令人驚訝的是，在 ULS 下HAECs 的條件培養基中也檢測到 HEG1 蛋白，但在 OSS 或靜態培養基中未檢測到（圖1 C）。為了進一步描述這種血流反應，進行了 2 種不同的時間過程研究。結果表明，HEG1 蛋白在最初前 3 小時內減少，因為它在響應ULS時連續釋放到介質中而沒有新的轉錄，6 小時后，HEG1 mRNA 和蛋白表達恢復，表明新的轉錄和翻譯呈血流依賴性（圖1 D-I）。

免疫熒光顯微鏡檢測表明，與靜態或 OSS 條件相比，暴露于 ULS 24 小時增加了 HAECs 中 HEG1 蛋白的表達（圖1 J）。令人驚訝的是，與在靜態細胞和 OSS 細胞中觀察到的彌漫性染色模式不同，HEG1 染色模式在 ULS 的刺激下顯示出對 ECs 下游的顯著定位。進一步測試發現，在 ULS 條件下，早在 2 分鐘，HEG1 蛋白就向下游移動至細胞間連接區域（圖1 K），表明s-flow 可快速誘導 HEG1 蛋白易位至 ECs 的下游。這些體外和體內結果表明，血流調節 HEG1 基因、蛋白質表達、極化定位以及條件培養基中的釋放。

在確定 HEG1 是一種血流敏感基因和因 s-flow 而增加的蛋白質后，在流動條件下通過 siRNA 敲低在 HAECs 中測試其功能意義。正如預期的那樣，ULS 抑制了 HAECs 的單核細胞粘附、通透性和遷移反應，而使用 siRNA 敲低 HEG1 可以阻止這些作用。此外，敲低 HEG1 還阻止了 ULS 介導的對 HAECs 中VCAM1 抑制以及 eNOS 誘導的影響。這些結果表明，HEG1 在介導 s-flow誘導的內皮功能調節中起關鍵作用。

圖1  體外單向層流剪切應力（ULS）誘導人主動脈EC（HAEC） HEG1 mRNA 和蛋白質表達，刺激蛋白質分泌到培養基中并在向下游易位。

接下來研究了 HEG1 介導 EC 中 s-flow 效應的機制，假設 HEG1 調節 2 個關鍵 s-flow 誘導的轉錄因子 KLF2/4 的表達，這反過來介導 s-flow 的轉錄和功能效應。為了檢驗這一假設，在用 siHEG1 和 ULS 處理 3 小時的 HAECs 中檢測 KLF2/4 mRNA 和蛋白表達，發現HEG1 表達降低。ULS 顯著誘導了 KLF2/4 mRNA 和蛋白質表達，而敲低 HEG1 會顯著減弱 KLF2/4 mRNA 和蛋白表達。這清楚地證明了 HEG1 在 ULS 調節 KLF2/4 表達中的關鍵作用。

ULS 通過激活 ECs 中的 MEKK3-MEK5-ERK5-MEF2 通路來調節 KLF2/4 表達，但上游血流激活機制仍然未知。因此，使用特異性藥理學抑制劑和 HEG1 siRNA 敲低測試了HEG1通過ULS調節KLF2/4表達是否也由 MEKK3-MEK5-ERK5-MEF2 通路介導。正如預期，ULS 增加了 ERK5 磷酸化，而敲低 HEG1降低了磷酸化，這提供了 HEG1 調控 ERK5 的關鍵證據，ERK5 是 ULS 介導的 KLF2/4 表達通路中的關鍵信號蛋白。

然后，用 MEKK3（Ponatinib）、MEK5（BIX02189）和 ERK5（XMD8-92）的特異性抑制劑處理 HAECs，檢測 HEG1 與 MEKK3-MEK5-ERK5-KLF2/4 通路響應 ULS 的層次關系。Ponatinib、BIX02189、XMD8-92處理均抑制 ULS 誘導的 ERK5 磷酸化和 KLF2/4 表達，但對 HEG1 表達沒有影響。這些結果表明，HEG1 是 ULS 誘導的 ECs 中 MEKK3-MEK5-ERK5-KLF2/4 通路的上游調節因子。此外，還發現HAECs 中過表達 KLF4 挽救了 ULS 對 eNOS 誘導、VCAM1 抑制和遷移抑制的影響。這些結果進一步驗證了 HEG1 通過調控 MEKK3-MEK5-ERK5-KLF2/4 通路介導保護性 ULS 對 EC 功能的影響。

KRIT1，也稱為腦海綿狀血管畸形1（CCM1），是 MEKK3 激活的抑制劑。盡管已知 KRIT1 和 CCM 復合物與 MEKK3 的解離會激活 MEKK3-KLF2/4 通路，但尚不清楚 KRIT1 是否調節血流誘導的 MEKK3-KLF2/4 通路。實驗結果表明，敲低KRIT1 增強了 ULS 下 ERK5 磷酸化和 KLF2/4 表達，證明了 KRIT1 在 MEKK3-MEK5-ERK5-KLF2/4 通路血流激活中的抑制作用（圖2 A）。有趣的是，盡管 ULS 增加了 KRIT1 mRNA 表達，但 ULS 降低了細胞裂解物中的 KRIT1 蛋白水平（圖2 B）。

因為已知 KRIT1 結合 HEG1，且數據顯示 HEG1 蛋白響應 ULS 釋放到培養基中，因此測試了 KRIT1 蛋白是否也與 HEG1 一起釋放到培養基中。令人驚訝的是，KRIT1 響應 ULS 而釋放到培養基中，而不是在靜態或 OSS 條件（圖2 C）。在 ULS 條件下，敲低HEG1 阻止了 KRIT1 的釋放（圖2 D），并且細胞裂解物中的 KRIT1 蛋白恢復到對照水平（圖2 E）。這些結果表明，KRIT1 以 HEG1 依賴性方式釋放到培養基中。HEG1 與 KRIT1 的免疫共沉淀進一步支持了這一結果，無論剪切條件如何，它都保持不變（圖2 F）。

這些結果提出了一個有趣的假設，即 ULS 促進 HEG1 與 MEKK3 抑制劑 KRIT1 一起從 ECs 釋放到培養基中，從而激活 MEKK3-MEK5-ERK5-KLF2/4 通路。

圖2  ULS 降低細胞內以 HEG1 依賴性方式釋放的 KRIT1 蛋白水平，刺激 ERK5-KLF2/4 通路。

此外，使用高脂飲食小鼠急性 PCL 模型測試了他莫昔芬誘導的 EC 特異性 HEG1 敲除對動脈粥樣硬化的影響，發現EC 中的 HEG1 敲除顯著加速晚期斑塊的發展，其特征是脂質病變面積、壞死核心面積和 CD68 陽性巨噬細胞浸潤增加。然后，使用常規飲食誘導的動脈粥樣硬化模型，在不進行PCL手術的情況下測試了他莫昔芬誘導的 EC 特異性 HEG1 敲除對動脈粥樣硬化的影響，發現HEG1 敲除小鼠以性別和主動脈位置依賴的方式比對照小鼠出現更多的動脈粥樣硬化斑塊。這些結果表明，HEG1 敲除小鼠的PCL模型中的頸動脈和慢性模型中的主動脈弓在兩性中都表現出強烈的動脈粥樣硬化惡化。然而，HEG1敲除小鼠在雄性降主動脈和主動脈竇中表現出適度的致動脈粥樣硬化作用，而在雌性中則沒有，證明了內皮 HEG1 缺失的主動脈位置和性別依賴性促動脈粥樣硬化作用。

最后，實驗測試了 HEG1 表達水平是否與人冠狀動脈粥樣硬化斑塊的嚴重程度相關。結果表明，在未患病的人冠狀動脈的 ECs 中發現豐富的 HEG1 表達。然而，與未患病的ECs相比，HEG1 蛋白在晚期動脈粥樣硬化病變（范圍 III-IV 和 V-VI）上的 ECs 中表達降低（圖3 A、B）。這些結果表明，內皮 HEG1 表達的降低與人冠狀動脈的晚期動脈粥樣硬化發展相關，突出了 HEG1 表達的臨床相關性。

圖3    HEG1表達在晚期斑塊的冠狀動脈中顯著降低。

（C）響應 ECs 中的 d-flow（OSS）和 s-flow（ULS）的HEG1 調控機制和作用。在 d-flow 條件下，HEG1 蛋白以低水平表達，隨機位于 EC 膜中，并與 KRIT1 結合，使 MEKK3 失活，導致 KLF2/4 低表達和致動脈粥樣硬化表型。在 s-flow條件下，HEG1 蛋白易位到下游，并與 KRIT1 一起分泌到培養基中，導致 MEKK3-MEK5-ERK5-MEF2 通路激活，誘導 KLF2/4 表達。KLF2/4 是s-flow 誘導的轉錄因子，可誘導數百個靶基因的表達，從而維持 EC 穩態和動脈粥樣硬化保護。

總之，該研究顯示，HEG1 是一種新型的動脈粥樣硬化保護性、血流敏感蛋白，在 ECs 中以 KRIT1 依賴性方式調節 MEKK3-MEK5-ERK5-MEF2-KLF2/4 通路。血流依賴性 HEG1-KRIT-MEKK3-MEK5-ERK5-MEF2-KLF2/4 通路為抗動脈粥樣硬化療法的開發提供了新的靶點。

參考文獻：Tamargo IA, Baek KI, Xu C, Kang DW, Kim Y, Andueza A, Williams D, Demos C, Villa-Roel N, Kumar S, Park C, Choi R, Johnson J, Chang S, Kim P, Tan S, Jeong K, Tsuji S, Jo H. HEG1 Protects Against Atherosclerosis by Regulating Stable Flow-Induced KLF2/4 Expression in Endothelial Cells. Circulation. 2024 Apr 9;149(15):1183-1201. doi: 10.1161/CIRCULATIONAHA.123.064735. Epub 2023 Dec 15. PMID: 38099436; PMCID: PMC11001532.

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