前言

類器官已成為生命科學和醫學研究領域的“明星模型”，在疾病機制研究、藥物篩選、精準醫療等方面展現出巨大潛力。然而，許多科研人員在嘗試類器官培養時，常常面臨“無法形成結構”、“細胞活性低”、“傳代失敗”等問題。

探究其根本，培養體系中細胞因子的選擇和配比可能是成敗的關鍵！

接下來，我們將會結合類器官經典培養方案WENR（Wnt3a、EGF、Noggin、R-Spondins），解析“四大護法”如何各顯神通，助你攻克類器官培養難關！

01 WENR何以成為類器官培養經典？

類器官的經典培養方案WENR（或稱為WNER）最初由荷蘭Hubrecht研究所的Hans Clevers團隊開發，其核心成分包括Wnt-3a、EGF、Noggin和R-Spondins。常被稱為類器官培養的“四大護法”。

WENR方案在類器官的研究與實踐中不斷演化，通過與其他細胞因子或小分子抑制劑的巧妙結合，衍生出適用于多種類器官構建的培養條件。目前，WENR方案已在胃、小腸、結腸、胰腺、肝臟等多種類器官培養中得到廣泛應用。

WENR方案用于多種類器官培養（源自Bindi M. Doshi, PhD.）

02 WENR“四大護法”

1 Wnt-3a：干細胞增殖的“發動機”

Wnt-3a作為經典Wnt通路的激活劑，通過穩定β-catenin蛋白，啟動下游靶基因（如c-Myc、Cyclin D1），參與細胞發育、增殖和分化過程。Alessandra Merenda在其綜述中深入總結了Wnt信號通路在類器官領域的關鍵作用。文中指出，無論成體干細胞組織來源如何，其衍生的類器官在增殖、干性維持及終末分化特化細胞等關鍵環節，都依賴于經典Wnt信號通路。如在小鼠結腸類器官的建立過程中，添加外源性Wnt-3a對其增殖至關重要。不添加Wnt-3a，類器官超過3天后無法存活。

Wnt-3a在腸類器官中培養中的作用（源自文獻：doi: 10.1016/j.tcb.2019.10.003）

2 EGF：細胞增殖的“加速器”

表皮生長因子（EGF）與受體結合，激活MAPK/ERK通路，促進細胞增殖和存活。EGF刺激上皮細胞增殖、血管生成和表皮細胞分化，促進類器官三維結構的形成。EGF廣泛應用于胃腸道、肝臟、甲狀腺等類器官培養，促進細胞集落形成和組織結構穩定性。盡管EGF并非類器官形成的必需因子，但能顯著增加類器官體積。

優化的WENR方案在人胃腸道類器官構建過程中的應用（源自文獻：doi: 10.1186/s13619-020-00040-w）

3 Noggin：抑制分化的“守門員”

在類器官構建過程中，Noggin與細胞增殖密切相關。Noggin是一種骨形態發生蛋白（BMP）的內源性抑制劑，通過阻斷BMP與受體結合，促進干細胞增殖，為類器官形成提供充足的細胞。Noggin還通過抑制BMP信號通路，維持干細胞干性，影響細胞的命運決定和分化過程。

在類器官培養中，Noggin常與Wnt-3a和R-Spondins一起使用，以平衡BMP和Wnt信號通路，促進類器官的生長和分化。因此，Noggin在類器官培養中不僅促進增殖，還精細調控細胞的分化。

Noggin抑制細胞增殖的分子機制（源自文獻：doi: 10.1242/bio.20149977）

4 R-Spondins：Wnt信號的“放大器”

R-spondin是Wnt信號通路的激活劑，通過與Frizzled和LRP5/6受體結合，增強Wnt信號在多種組織中的表達，促進干細胞增殖與類器官結構形成。T. Thalheim等人發現，沒有R-spondin時，類器官在4-5天后停止生長。在1.2% R-spondin濃度下培養的類器官生長非常迅速，生長時間超過5天后經常破裂，其管腔內積累了大量細胞碎片。在10%或25% R-spondin濃度下培養的類器官生長速度比1.2%稍慢，但不會破裂。

不同濃度的R-spondin影響腸類器官的生長狀態（源自文獻：doi: 10.1016/j.ydbio.2017.10.013）

03 WENR實戰避坑Tips

Wnt過度激活會導致類器官結構紊亂，因此Wnt-3a濃度需嚴格控制。并且R-spondin需要和Wnt-3a協同使用，單獨使用效果有限。建議根據類器官類型優化Wnt-3a的濃度，一般為50-100 ng/mL。在培養后期也可以動態調控其濃度。

EGF易被蛋白酶降解，建議使用無血清培養基。EGF長期高濃度，可能會誘導異常分化，建議定期更換培養基。EGF一般使用濃度為50 ng/mL。在腫瘤類器官（如腸癌）中，其濃度需根據癌細胞特性調整。

Noggin與Wnt-3a協同作用，支持胃、腸道、肝臟、肺、胰腺等類器官的長期培養。在肺類器官培養中，Noggin缺失會導致肺泡上皮細胞過早分化。在肝類器官中，其與Wnt3a的“雙劍合璧”是長期傳代的關鍵。BMP信號的過度激活會導致類器官形成囊狀結構，失去功能性隱窩結構。

S-spondin有4個亞型（RSPO1-4），不同組織來源的類器官可能需特異性選擇。Wnt-3a和R-spondin易失活，建議分裝后-80℃保存。

常見問題排查表，僅供參考：

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【參考文獻】

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