活性氧（ROS）和活性氮（RNS）是已知的導致氧化應激有害效應的分子。自由基的積累以及氧化應激的增加已被認為與多種疾病的發生機制有關。氧化應激在血管疾病、糖尿病、腎臟缺血、動脈粥樣硬化、肺部病理狀態、炎癥性疾病、癌癥以及衰老中的作用已被廣泛證實。自由基和其他活性物質在體內不斷產生，并對生物分子造成氧化損傷，這一過程通過多種抗氧化和修復系統以及受損核酸、蛋白質和脂質的替換來控制。測量抗氧化療法的效果以及ROS/RNS活性對于抑制或治療氧化應激誘導因子至關重要。

OxiSelect™體外ROS/RNS檢測試劑盒是一種用于測量樣本中總自由基含量的檢測工具。該試劑盒采用一種專有的淬滅型熒光探針——二氯二氫熒光素DiOxyQ（DCFH-DiOxyQ），這是一種基于流行的2',7'-二氯二氫熒光素二乙酸酯類似化學原理的特異性ROS/RNS探針。DCFH-DiOxyQ探針首先用淬滅去除試劑進行預處理，隨后穩定在高活性的DCFH形式中。在這種高活性狀態下，ROS和RNS可以與DCFH反應，DCFH迅速被氧化為高熒光的2',7'-二氯熒光素（DCF）。熒光強度與樣本中的總ROS/RNS水平成正比。DCFH-DiOxyQ探針可以與過氧化氫（H?O?）、過氧自由基（ROO?）、一氧化氮（NO）和過氧亞硝酸根（ONOO?）反應。這些自由基分子分別代表了ROS和RNS，從而可以測量樣本中的總自由基群體。OxiSelect™體外ROS/RNS檢測試劑盒還可以用于評估抗氧化劑對自由基的影響。該試劑盒對DCF的檢測靈敏度為10 pM，對H?O?的檢測靈敏度為40 nM。每個試劑盒提供足夠的試劑，可進行多達96次檢測，包括標準曲線和未知樣本。

艾美捷OxiSelect體外ROS/RNS檢測試劑盒(綠色熒光)（#STA-347）是一種體外檢測工具，用于測量總ROS/RNS自由基活性。未知的ROS或RNS樣本或標準品與一種催化劑一起加入孔中，該催化劑有助于加速氧化反應。經過短暫孵育后，將制備好的DCFH探針加入所有孔中，允許氧化反應進行（見圖1）。樣本通過熒光法與過氧化氫或DCF標準品進行測量。該檢測在96孔熒光平板格式中進行，可在標準熒光平板讀數器上讀取。通過與預先確定的DCF或過氧化氫標準曲線比較，確定未知樣本中的自由基含量。

OxiSelect體外ROS/RNS檢測試劑盒組分（室溫運輸）：

1. 預處理試劑（部件編號234701）：1支250 µL溶液管。

2. 穩定化溶液（10X）（部件編號234702）：1支1.5 mL溶液管。

3. 催化劑（250X）（部件編號234703）：1支20 µL溶液管。

4. DCF-DiOxyQ（部件編號234704）：1支50 µL棕色管，甲醇溶液。

5. DCF標準品（部件編號234202）：1支100 µL棕色管，1 mM DMSO溶液。

6. 過氧化氫（部件編號234102）：1支100 µL棕色管，8.821 M溶液。

未提供材料：

1. 磷酸鹽緩沖液，用于樣本制備和稀釋

2. 96孔黑色或熒光微量滴定板

儲存：

收到后，將DCF-DiOxyQ和DCF標準品儲存于-20oC。避免多次凍融循環。將所有其他組分儲存于4oC。

試劑準備：

- 1X穩定化溶液：將10X穩定化溶液按1:10稀釋，即向1.5 mL溶液中加入13.5 mL去離子水。攪拌或渦旋至均勻。將溶液儲存于4oC。

- 1X催化劑：使用前，將250X催化劑在PBS中按1:250稀釋。充分渦旋。僅準備足夠立即使用的量（例如，向2.49 mL PBS中加入10 µL催化劑，用于50孔）。

- DCFH溶液：僅在棕色管或用鋁箔覆蓋的管中準備足夠立即使用的DCFH溶液。通過將DCF-DiOxyQ原液與預處理試劑按1:5稀釋來制備DCFH溶液（例如，對于50次檢測，向100 µL預處理試劑中加入25 µL DCF-DiOxyQ）。渦旋至均勻。在室溫下孵育溶液30分鐘。然后，將反應液用1X穩定化溶液按1:40稀釋（例如，對于50次檢測，將125 µL DCF-DiOxyQ/預處理試劑反應液加入到4.875 mL穩定化溶液中）。渦旋至均勻。避光保存。該溶液現在以DCFH形式穩定，可直接使用。當避光保存時，該溶液可在-20oC下穩定保存長達一周。

注意：由于光誘導的自氧化作用，DCF-DiOxyQ原液以及所有后續的DCF-DiOxyQ和DCFH溶液都必須避光保存。

結果示例：

以下圖表展示了典型的自由基ROS/RNS檢測結果。熒光測量是在Molecular Devices的SpectraMax Gemini XS熒光光度計上進行的，使用485/538 nm濾光片組和530 nm截止濾光片。以下數據僅供參考，不應用于解釋實際結果。

過氧化氫標準曲線

相關產品：

1. STA-330：OxiSelect™ TBARS檢測試劑盒（丙二醛定量）

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3. STA-341：OxiSelect™過氧化氫酶活性檢測試劑盒

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OxiSelect體外ROS/RNS檢測試劑盒(綠色熒光)引用文獻：

1. Bass DA, Parce JW, Dechatelet LR, Szejda P, Seeds MC, Thomas M. Flow cytometric studies of oxidative product formation by neutrophils: A graded response to membrane stimulation. J Immunol.1983; 130:1910-1917.

2. Brandt R, Keston AS. Synthesis of diacetyldichlorofluorescin: A stable reagent for fluorometric analysis. Anal Biochem. 1965; 11:6-9.

3. Keston AS, Brandt R. The fluorometric analysis of ultramicro quantities of hydrogen peroxide. Anal Biochem.1965; 11:1-5.