Tenascin-X Mediates Flow-Induced Suppression of EndMT and Atherosclerosis

Keywords: atherosclerosis; carotid arteries; endothelium; hemodynamics; inflammation; transforming growth factor beta.

動脈粥樣硬化是一種累及大中型動脈的慢性、進行性、炎癥性疾病，最終可導致急性心血管事件，如心肌梗死和中風。層流和擾動流會激活內皮細胞中不同的信號轉導通路，分別導致抗動脈粥樣硬化表型和致動脈粥樣硬化表型。最近，體外和體內研究表明，暴露于擾動流的內皮細胞經歷內皮-間充質轉化（EndMT），這通過細胞間粘附的溶解、細胞極性的改變和間充質標志基因的表達來促進動脈粥樣硬化的發展。與擾動流相反，單向層流抑制 EndMT。TGF-β（轉化生長因子β）是驅動 EndMT 的核心介質，內皮 TGF-β 已被證明與動脈粥樣硬化的進展有關。然而，人們對內皮 TGF-β 信號在動脈粥樣硬化發展過程中如何激活以及層流和紊亂血流如何調節內皮 TGF-β 信號傳導知之甚少。

肌腱蛋白X（TN-X，tenascin-X）是 tenascin 家族的細胞外基質糖蛋白，可形成同源三聚體，并具有多結構域結構。缺乏該蛋白會導致經典型艾勒斯-當洛綜合征，即彈性蛋白或膠原蛋白結構異常，引起皮膚、關節和血管的脆弱性增加。

基于此，德國普朗克心肺研究所、法蘭克福歌德大學分子醫學中心及中國西安交通大學醫學部基礎醫學院心血管研究中心的研究團隊于 Circulation Research 期刊在線發表了題為“Tenascin-X Mediates Flow-Induced Suppression of EndMT and Atherosclerosis”的研究成果，表明內皮細胞響應單向層流表達 TN-X，并通過結合 TGF-β 抑制內皮細胞中 TGF-β誘導的信號，從而介導對 EndMT 和動脈粥樣硬化的保護。

首先，為了鑒定被層流上調的基因，將人臍靜脈內皮細胞保持在靜態條件或暴露于單向層流（12 dynes/cm2，48 h），發現 >500個基因發生變化，除了流量依賴性表達基因（如 KLF2 和 KLF4）外，還發現其他幾個基因被強烈上調，包括編碼細胞外基質糖蛋白 TN-X 的 TNXB (圖1 A）。與靜態條件下的低表達相比，暴露于層流 24 小時導致其 RNA 和蛋白質水平強烈上調（圖1 B、C）。雖然單向層流增加了 TNXB 表達以及包括 KLF2 和 KLF4 在內的其他血流依賴性基因的表達（圖1 B），但誘導炎癥基因（包括 CCL2 和 VCAM1）表達的振蕩流（4 dynes/cm2，1 Hz）不會誘導 TNXB 或 KLF2 和 KLF4 的表達（圖1 D、E）。

然后，測試了幾種機械感應和機械信號蛋白，如 PIEZO1、ERK5、KLF2 和 KLF4 的敲低是否影響層流誘導的 TNXB 表達，發現雖然敲低 PIEZO1、ERK5 和 KLF2 對層流誘導的 TNXB 上調沒有影響，但抑制 KLF4 表達降低了層流誘導的 TNXB 表達。進一步分析表明，KLF4 與至少 2 個結合位點的結合在流動反應中增加，其中一個結合位點發生突變時，導致層流誘導的TNXB啟動子激活喪失，表明其在介導KLF4-依賴性TNXB 表達調控中的關鍵作用。以上這些數據表明，層流誘導的 TNXB 表達是由 KLF4 介導的。

為了測試層流是否也在體內誘導 TNXB 表達，分析了在 Tnxb 啟動子控制下表達 β-半乳糖苷酶的小鼠細胞系。在主要暴露于單向層流的主動脈弓外曲率內皮中，β-半乳糖苷酶活性明顯高于血流受干擾的主動脈弓內曲率內皮（圖1 F）。對內皮細胞特異性 TN-X 缺失小鼠進行分析，發現培養基中 TN-X 的染色不受 TN-X 內皮丟失的影響。在人主動脈切片中，還發現 TNXB 在層流區域（如降主動脈）的內皮層中高表達，而在主動脈弓內曲率的內皮表達相對較低（圖1 G、H）。此外，人主動脈內皮細胞 TNXB 的表達與 VCAM1 的表達呈負相關（圖1 G、I）。這些數據表明，當體外和體內暴露于單向層流剪切應力時，內皮細胞的 TNXB 表達強烈增加。

圖1    層流剪切應力誘導內皮 TN-X（tenascin-X）的表達。

為了研究體內條件下的內皮 TN-X 功能，研究了 EC-Tnxb-KO 小鼠。兩周后，觀察到 Vcam1 表達和內皮下 CD68 陽性細胞的數量都強烈增加。這些改變不僅在主動脈弓的內曲率中觀察到，而且在外曲率中也觀察到。繼續進行部分頸動脈結扎術誘導內皮功能障礙和動脈粥樣硬化，發現小鼠內皮細胞特異性 TN-X 丟失導致頸動脈新內膜形成強烈增加。16 周后，小鼠的主動脈、主動脈根部以及頭臂動脈中動脈粥樣硬化斑塊的發生和進展強烈增加。在暴露于單向層流的區域（如降主動脈）和暴露于擾動流的區域（如主動脈弓的內曲率）中，都觀察到動脈粥樣硬化進展增加。

接下來，為了了解缺失 TN-X 的情況下內皮炎癥增加的機制，分析了暴露于不同流動模式的內皮細胞的各種標志物。RT-qPCR 顯示 EndMT 標志物的表達增加，如 fn1、Notch3、Vim、Mmp2、Mmp9、Fsp1、Acta2、Zeb1 和 Twist1。這伴隨著 EC-Tnxb-KO 小鼠內主動脈內皮中 Smad2 的磷酸化增加，這表明在沒有 TN-X 的情況下 TGF-β 信號增加。同樣，在人降主動脈和主動脈弓內曲率中也發現 TN-X 表達與纖連蛋白的表達和 Smad2 的磷酸化呈負相關。

為了測試缺失 TN-X 的情況下 EndMT 和炎癥標志物表達的增加以及 Smad2 磷酸化的增加是否確實是由于 TGF-β 活性的增加，用抗-TGF-β 抗體處理 EC-Tnxb-KO 小鼠。在內皮 TN-X 缺失的情況下，抑制 TGF-β 阻斷了 Smad2 磷酸化增加以及 EndMT 炎癥標志物表達的增加（圖2 A、C），還強烈減少了小鼠部分頸動脈結扎后新內膜的形成（圖2 D、E）。此外，LDL（低密度脂蛋白）受體缺陷型小鼠TN-X 缺失的內皮細胞中動脈粥樣硬化進展的增加（圖2 F、G）。

為了測試內皮 TGF-β 信號是否導致 EndMT 標志物表達增加，生成TN-X 以及 TGF-β 受體1、2丟失的小鼠，發現在 EC-Tnxb-KO 小鼠中Smad2 磷酸化水平和纖連蛋白表達的增加降低到對照水平。此外，缺乏 LDL 受體的小鼠中觀察到的新內膜形成增加，當內皮細胞中缺乏 TGF-β 受體 1 和 2 時也減少。這些數據表明，內皮細胞 TN-X 丟失后，EndMT 和炎癥是由內皮細胞中 TGF-β 信號增加引起的。

圖2    抑制 TGF-β  阻斷 EC-Tnxb-KO 小鼠EndMT 和血管炎癥的發展。

由于 TN-X 在內皮細胞中的缺失會引起典型的 TGF-β介導的藥物變化，這可以通過 TGF-β 的藥理學抑制來阻斷，實驗假設 TN-X 抑制 TGF-β 活性或其下游信號。因此，研究人員確定了 TN-X 濃度增加對人臍靜脈內皮細胞中 TGF-β 誘導的 Smad2/Smad3 磷酸化的影響，并發現 TN-X 抑制 TGF-β 的作用（圖3 A）。此外，層流誘導的 TNXB 表達伴隨著 TGF-β誘導的 Smad 磷酸化強烈降低。然而，當層流誘導的 TNXB 表達被小干擾 RNA 介導的敲低阻斷時，這種效果未被觀察到（圖3 B）。這表明內源性上調的 TN-X 也能夠在體外抑制 TGF-β。

最后，為了進一步表征 TN-X 對 TGF-β誘導的細胞效應的影響，研究了 TGF-β 與固定 TGF-β 受體在TN-X 的 C 端部分（由 5 個 FN （纖連蛋白）III 型樣結構域和纖維蛋白原樣結構域組成）缺失或存在的情況下的結合，發現TN-X 以濃度依賴性方式抑制 TGF-β 與其受體的結合（圖3 C）。

為了測試 TN-X 是通過與受體結合還是與 TGF-β 結合來阻斷 TGF-β 與其受體之間的相互作用，進行免疫共沉淀實驗分析 TN-X 與 TGF-β 及其受體的相互作用。成熟的 TGF-β 與抗-TN-X 抗體特異性共沉淀，反之亦然（圖3 D），而沒有觀察到 TN-X 與 TGF-β 受體的細胞外部分共沉淀（圖3 D），而細胞外部分很容易與 TGF-β 共沉淀。亞結構域分析顯示，FBG 結構域（而不是 FN III 型樣結構域）與 TGF-β 相互作用（圖3 E）。這些數據強烈表明，TN-X 通過其 FBG 結構域直接與 TGF-β 相互作用，從而阻止其與 TGF-β 受體相互作用。

圖3    TN-X 結合 TGF-β 并作為 TGF-β清除劑發揮作用。

TN-X 在保護內皮細胞免受 TGF-β誘導的 EndMT 中的流動依賴性功能的示意圖。單向層流誘導內皮 TNXB 的表達。同源三聚體 TN-X 通過其 C 端 FBG 結構域與 TGF-β 結合，從而阻止 TGF-β 與其在內皮細胞上的受體結合。

總之，這項研究數據將 TN-X 確定為生理剪切應力發揮抗炎和動脈粥樣硬化保護活性的核心效應子，其作用機制是抑制 TGF-β 活性和 EndMT。模擬 TN-X 介導的 TGF-β 和 EndMT 抑制可能是干擾慢性炎癥性血管疾?。ㄈ鐒用}粥樣硬化）進展的新機制。

參考文獻：Liang G, Wang S, Shao J, Jin YJ, Xu L, Yan Y, Günther S, Wang L, Offermanns S. Tenascin-X Mediates Flow-Induced Suppression of EndMT and Atherosclerosis. Circ Res. 2022 May 27;130(11):1647-1659. doi: 10.1161/CIRCRESAHA.121.320694. Epub 2022 Apr 21. PMID: 35443807.

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