一、菌落計數的一般步驟

1、樣品的稀釋

2、培養和計數

3、結果與報告

二、具體過程

1、樣品的稀釋

（1）固體和半固體樣品

稱取25g置盛有225mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌均質杯內，8000r/min～10000r/min均質1min～2min，或放入盛有225mL稀釋液的無菌均質袋中，用拍擊式均質器拍打1min～2min，制成1：10的樣品勻液。

（2）液體樣品

以無菌吸管吸取25mL樣品置盛有225mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌錐形瓶（瓶內預置適當數量的無菌玻璃珠）中，充分混勻，制成1：10的樣品勻液。

上步完成后，用1mL無菌吸管或微量移液器吸取1：10樣品勻液1mL，沿管壁緩慢注于盛有9mL稀釋液的無菌試管中（注意吸管或吸頭不要觸及稀釋液面），振搖試管或換用1支無菌吸管反復吹打使其混合均勻，制成1：100的樣品勻液。

根據對樣品污染狀況的估計，選擇1個～3個適宜稀釋度的樣品勻液（液體樣品可包括原液），在進行10倍遞增稀釋時，吸取1mL樣品勻液于無菌平皿內，每個稀釋度做兩個平皿。同時，分別吸取1mL空白稀釋液加入兩個無菌平皿內作空白對照。

之后，及時將15mL～20mL冷卻至48℃的平板計數瓊脂培養基（可放置于48℃±2℃恒溫水浴箱中保溫）傾注平皿，并轉動平皿使其混合均勻。

2、注意事項

移液過程使用的器具，都應避免微生物污染。使用耐高壓移液槍，核查洗耳球無菌程度，避免移液槍觸及均質袋或試管內壁……

樣品勻液完成后，可按相同操作，制備10倍系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋一次，換用1次1mL無菌吸管或吸頭。

3、培養和計數

樣品稀釋完成后，就要進行培養和菌落計數了。

待瓊脂凝固后，將平板翻轉，36℃±1℃培養48h±2h。水產品30℃±1℃培養72h±3h。

如果樣品中可能含有在瓊脂培養基表面彌漫生長的菌落時，可在凝固后的瓊脂表面覆蓋一薄層瓊脂培養基（約4mL），凝固后翻轉平板，按相同條件進行培養。

培養完成后，就要進行菌落計數了，計數可用肉眼觀察，必要時用放大鏡或菌落計數器，記錄稀釋倍數和相應的菌落數量。菌落計數以菌落形成單位（colony-forming units，CFU）表示。

選取菌落數在30CFU～300CFU之間、無蔓延菌落生長的平板計數菌落總數。低于30CFU的平板記錄具體菌落數，大于300CFU的可記錄為多不可計。每個稀釋度的菌落數應采用兩個平板的平均數。

（1）大片菌落

其中一個平板有較大片狀菌落生長時，則不宜采用，而應以無片狀菌落生長的平板作為該稀釋度的菌落數；若片狀菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均勻，即可計算半個平板后乘以2，代表一個平板菌落數。

（2）鏈狀生長

當平板上出現菌落間無明顯界線的鏈狀生長時，則將每條單鏈作為一個菌落計數。

（3）結果與報告

為了生成結果和報告，需要根據計數結果和公式計算出菌落總數。需要注意的是，對于菌落數量不同的培養皿，計數原則有所不同。

若所有平板上為蔓延菌落而無法計數，則報告菌落蔓延。若空白對照上有菌落生長，則此次檢測結果無效。

稱重取樣以CFU/g為單位報告，體積取樣以CFU/mL為單位報告。

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