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【實驗安全處置篇】免疫組化中的染色劑

來源:武漢博歐特生物科技有限公司   2025年04月09日 10:26  

【實驗安全處置篇】免疫組化中的染色劑

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免疫組化在臨床及病理診斷中已廣泛應用,對疾病的判定、鑒別診斷及判定疾病的預后及臨床醫師對疾病的治療具有重要的指導意義。其在蛋白抗原的細胞準確定位上是其他蛋白檢測方法無法相比的。
免疫組化的基本操作異常結果分析我們在之前的文章中已經和大家分享過了,今天我們主要來說一說免疫組化中經常用到的“底物和染色劑”!
對于辣根過氧化物酶來說,我們常規用DAB(二氨基聯苯胺)或AEC(3-氨基-9-乙基咔唑)染色。
DAB(二氨基聯苯胺)染色劑
DAB(二氨基聯苯胺)通常作為過氧化物酶最敏感、*常用的顯色底物細胞顆粒中的過氧化物酶,能將過氧化氫中的氧釋放出來,氧化二氨基聯苯胺,形成棕黃色沉淀而定位于過氧化物酶活性的部位。反應產物不溶于水、二甲苯和醇,因而適用于多數復染劑和封片劑
在DAB顯色后,還可以使用溶于乙醇的染料進行后續染色。可配合DAB染色使用的復染方法包括亞甲基藍、甲基綠和蘇木精。
另外因為其電子密度高,可用于電子顯微鏡觀察。還可以通過用硫酸鎳或氯化鉆進行后處理,可以產生更好的對比度。


左:人乳腺纖維瘤組織的免疫組織化學染色anti-CD206 (Biorbyt,dilution at 1:100)   

右:小鼠皮膚組織的IHC-P染色anti-CD45 (Biorbyt,dilution at 1:100)



但是DAB屬于聯苯胺類化合物(BZC)中的一種,現已被證實具有免疫毒性、生殖毒性、遺傳毒性、致癌性等毒性,尤其對泌尿系統可致膀胱癌,被國際癌癥研究中心(IARC)確認為致癌物。如果用DAB,液體配制應在通風櫥內進行,操作者應戴口罩和手套。一般認為工作液危害較小;但粉劑危害較大。除使用過程中要特別注意安全防護外,使用后的廢液存放和去毒性處理也應引起高度重視


在我國由于實驗室比較分散,單個實驗室產生的廢液量較少,很少受到實驗使用人員和有關部門的重視,大多實驗室都是未經任何處理直接排入下水道,這種情況下日積月累、積少成多也是非常可怕的。為保護環境,減少污染,每個使用DAB的實驗室應當把DAB廢液的去毒性處理制定成一項實驗室守則,嚴格執行。


DAB的毒性處理原則是DAB分子-全被破壞且反應副產物和終產物也必須不具備誘變性。一直被沿用至今的是“硫酸-高錳酸鉀法”,DAB被處理后不但分子被*全破壞,反應終產物也無誘變性,處理后可以按普通實驗室廢液處置。具體處理步驟如下


1 硫酸-高錳酸鉀水溶液的配制

a.0.2 M高錳酸鉀水溶液:高錳酸鉀31.6 g,蒸餾水1000 ml;


b.2.0M的硫酸水溶液:濃硫酸112 ml,蒸餾水1000 ml。


2 收集廢棄DAB液     包括顯色后洗片、洗器皿的自來水和剩余的DAB顯色液,稀釋后DAB的濃度不超過0.9 mg/ml。



3 去毒性反應    廢棄DAB液每10 ml加入上述5 mla液和5 mlb液,混合后靜置不低于10 h或過夜,此時DAB的致癌性基本解除。



4 脫色     加入抗壞血酸或草酸脫色,邊加邊攪拌至廢液退至無色。



5 中和    加入碳酸氫鈉中和pH值6至8,經PH試紙檢測。



6 處理    有廢液回收條件的按普通實驗室廢液回收,沒有回收條件的可以混合大量自來水傾入下水道沖走。

與硫酸-高錳酸鉀法相比,被*認更有效的處理方式是焚燒廢棄物的處置方法,DAB廢棄物加入燃料被焚燒后苯環*全被破壞,排出的有毒的氮氧化物可以通過洗滌器除去。但焚燒法需要有專業的回收和存放,較適合集中DAB的毒性處理,而硫酸-高錳酸鉀法較適合實驗室使用。



AEC(3-氨基-9-乙基咔唑)染色劑
AEC(3-氨基-9-乙基咔唑),雖然溶于乙醇,因為比DAB致癌危險性低,目前也已經應用廣泛。
AEC產生鮮紅色,與用蘇木精復染可形成鮮明的對比。但注意應用不含乙醇的蘇木精,如Mayer,而不用Harris,以避免將溶于乙醇的AEC有色反應產物溶解。
當抗原- 抗體- 酶濃度高時,AEC 可能產生棕黃色產物(AEC有兩個反應位點,當其中一個被轉變時,變成紅色;當兩個都和過氧化物酶反應時,產生棕綠色產物)。pH值為4.8的乙酸緩沖液能減輕這一反應。切片應用水性介質(如80%甘油)封片。水性封片劑含有少量有機溶劑,可使染色慢慢溶解或消失。注意不能用乙醇脫水。甘油封片可用指甲油將蓋玻片邊緣密封以長期保存。
其他染色劑還有a-萘酚派若寧(粉色)、4-氯1-茶酚(藍色)和Hanker-Yates 以及大量廣譜染色劑 (見下表1)。反應底物也適用于堿性磷酸酶。有些底物在酶位點上持續反應,產生顆粒狀有色物質,從而使堿性磷酸酶系統反應更敏感。但如果反應過度,這些顆粒可能使組織形態模糊。





參考資料:

[1]陳慶,康維鈞,聯苯胺類化合物的毒性研究進展.河北醫科大學學報,2007,28(6):460.

[2]王晉芬,王躍華.DAB廢物處理程序中華病理學雜志,2005,34(12):775.

[3]David J.Dabbs.診斷免疫組織化學[M],第二版,周庚寅,翟啟輝,張慶慧,北京大學醫學出版社,2008.7:19-20。


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