丙酮酸是細胞代謝中的關鍵分子。它是糖酵解的最終產物，也是需氧和厭氧呼吸的初始步驟。在需氧條件下，丙酮酸進入線粒體，在那里它經歷進一步的氧化，通過克雷布斯循環和氧化磷酸化產生能量豐富的分子，如ATP。或者，在厭氧條件下，丙酮酸可以轉化為乳酸，再生糖酵解繼續所需的輔因子NAD+。丙酮酸還作為各種生物合成途徑的關鍵前體，包括氨基酸和脂肪酸的合成。它在能量生產和生物合成中的核心作用使丙酮酸成為細胞過程中的基本分子。AkrivisBio丙酮酸檢測是一種簡單敏感的方法，用于定量從低于1μM到10mM范圍內的丙酮酸，適用于各種生物樣本類型。

艾美捷丙酮酸測定試劑盒：

貨號：MA-0129

孔數：100孔

樣本類型：組織提取物、細胞裂解物、血清、血漿、尿液、其他生物液體

物種：所有物種

檢測方法：比色法，OD 570納米或熒光法，激發/發射 = 535/580納米

檢測類型：定量

應用：一種基于板的比色法/熒光法檢測，用于在1 μM - 10 mM范圍內定量各種生物樣本中的丙酮酸。

靈敏度：1 uM-10 mM

儲存條件：-20°C

運輸溫度：使用冰袋

丙酮酸測定試劑盒組分：

-檢測緩沖液25毫升WMMA-0129-A

-ADHP溶液200微升紅色MA-0129-B

-丙酮酸氧化酶/過氧化氫酶凍干綠色MA-0129-C

-丙酮酸標準品100微升黃色MA-0129-D

儲存和處理：將所有組件儲存在-20°C。使用前將其升至室溫。打開前短暫離心小瓶。

-檢測緩沖液：使用前升至室溫。儲存在4°C。

-ADHP溶液：升至室溫以融化DMSO溶液。混合均勻，儲存在-20°C。

-丙酮酸氧化酶/過氧化氫酶：加入220微升檢測緩沖液溶解。儲存在-20°C。

檢測方案：

1.標準曲線：

a.基于吸光度的檢測（樣本中約100μM–10mM）：通過將10微升標準品轉移到990微升檢測緩沖液中，將丙酮酸標準品稀釋至0.4mM。

b.基于熒光的檢測（約0.2μM–100μM）：通過向990微升檢測緩沖液中添加10微升標準品，然后將10微升轉移到90微升檢測緩沖液中，進一步稀釋丙酮酸標準品至最終濃度0.04mM。

c.混合均勻。將0–5–10–15–20–25微升加入96孔板中的一系列孔中。通過添加檢測緩沖液將所有孔的體積調整至50微升，為比色法檢測提供0,2,4,6,8,10納摩爾/孔的丙酮酸標準品。（熒光法檢測為0,200,400,600,800,1000皮摩爾/孔）。

2.樣本準備：用50微升檢測緩沖液勻漿組織（10毫克）或細胞（10^6）。以16,000Xg離心5分鐘，然后將5-50微升清澈上清液加入96孔板中的孔中。將唾液以16,000Xg離心5分鐘，然后加入10微升到孔中。可以直接向樣本孔中加入血清（10微升）。用檢測緩沖液將所有孔的體積調整至50微升。

注意：

a.血清中的LDH活性可以將丙酮酸轉化為乳酸。血清樣本應儲存在-80°C。解凍后立即使用。

b.使用10kDa旋轉柱對樣本進行去蛋白處理，以去除可能消耗丙酮酸的酶。

c.一些樣本背景較高。因此，以雙份運行樣本，并使用配對孔確定背景。

d.在極少數情況下，內源性化合物可能干擾酶反應。使用配對樣本，向其中一個測試樣本中添加內標（吸光度2-5納摩爾，熒光100皮摩爾），以準確測量丙酮酸（下面解釋的程序）。

3.啟動反應：為要運行的總孔數準備足夠的反應混合物。每個孔需要50微升含有以下成分的反應混合物：

1）反應混合物：

樣本/標準孔混合

背景對照混合

檢測緩沖液46微升（使用熒光時47.6微升）

ADHP溶液2微升（使用熒光時0.4微升）

丙酮酸氧化酶/過氧化氫酶2微升

2）向每個含有丙酮酸標準品和測試樣本的孔中加入50微升反應混合物。向背景孔中加入50微升背景對照混合。

4.測量：使用微孔板讀取器在室溫下通過吸光度（570納米）或熒光（激發/發射=535/590納米）監測反應30分鐘。

5.典型結果：

6.計算：從所有標準讀數中減去0標準讀數。繪制丙酮酸標準曲線并確定標準曲線的斜率。該值將用于計算未知測試樣本中的丙酮酸。如果運行了背景對照孔，則從每個配對未知樣本中減去背景讀數。將背景校正后的樣本信號除以標準曲線的斜率。這給出了孔中的納摩爾或皮摩爾丙酮酸。

對于添加了內標的樣本，從未知樣本中減去添加了已知量丙酮酸的未知樣本。獲得的信號是系統對添加量的響應。僅含有未知物的孔中丙酮酸的校正量={未知樣本信號/[（添加樣本信號-未知樣本信號）/添加量]}

要將孔中的量轉換為原始樣本中的丙酮酸量：

A.孔中的丙酮酸納摩爾數/加入孔中的樣本微升數=每微升樣本的丙酮酸納摩爾數。

B.每微升樣本的丙酮酸納摩爾數X樣本總體積（原始樣本+稀釋液體積）=樣本中的總丙酮酸納摩爾數

C.樣本中的總丙酮酸納摩爾數/組織毫克數（或細胞數或血清微升數等）=每毫克組織（細胞等）的丙酮酸納摩爾數。