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在精準醫療浪潮中，基因治療作為具潛力的前沿技術，從基因層面直擊疾病根源，有望實現「一次治療，終生獲益」的長期臨床效果。當下，基因治療已在罕見病、眼科疾病、神經退行性疾病以及腫瘤治療等難治性疾病領域取得突破性進展。

腺相關病毒（AAV）載體憑借高轉導效率、強組織與細胞靶向性，以及低免疫原性等顯著優勢，在基因治療領域脫穎而出，成為應用最為廣泛的基因遞送工具。

當前，美國食品和藥品監督管理局（FDA）已批準 8 款 AAV 基因療法上市。國內基因治療領域進展頗多。信念醫藥研發的針對血友病 B 的 AAV 基因療法正處于獲批上市的關鍵階段，有望填補國產 AAV 基因療法上市的空白。

今年 2 月，復旦大學附屬眼耳鼻喉科醫院舒易來教授憑借雙 AAV 基因療法，使耳聾患者聽力得到恢復，成為 34 年來榮獲“臨床科學創新獎” 的亞洲科學家。

同月，特寶生物通過收購九天生物部分資產，將多個 AAV 基因療法研發管線納入旗下，交易總價最高可達 5800 萬美元，這一舉措助力特寶生物迅速切入 AAV 基因療法領域，加速創新基因治療產品的開發與應用，也進一步彰顯了國內 AAV 基因療法產業的廣闊前景。

近日，一名接受 Sarepta 杜氏肌營養不良癥（DMD）基因療法 Elevidys 的青少年男孩因肝功能衰竭死亡。在接受 Elevidys 臨床試驗和商業治療的 800 多名患者中，這是第一例患者死亡病例。該事件在行業內引發軒然大波，引發各界對 AAV 基因療法安全性的深刻思考，也進一步凸顯出 AAV 生產環節嚴格把控的重要性。

事實上，AAV 病毒載體生產工藝開發面臨諸多挑戰。生產環節復雜，病毒載體生產與純化過程中存在工藝放大難、純化難度大、穩定性欠佳等問題，大規模生產仍是該領域亟待攻克的關鍵挑戰。

質量源于設計（QbD）理念強調了前置藥物的質量控制，這也意味著企業從原材料的選擇上就要嚴格把關以符合監管要求，規避后續可能存在的風險。現從 AAV 病毒生產上游工藝中質粒、產毒株細胞和質粒轉染三個方面剖析影響 AAV 生產規模化的影響因素。

質粒是生產 AAV 的起始原料，通常在重組大腸桿菌發酵過程中獲取。質粒生產流程涵蓋發酵、菌體收集、菌體裂解、固液分離、澄清、層析以及濃縮等多個環節。在質粒大規模發酵過程中，多個因素協同影響質粒產率。

在質粒大規模純化環節，堿裂解法是裂解菌體的常用方法。在此過程中，需嚴格控制 pH 值、剪切力和裂解時間，防止過度裂解對質粒造成損傷。層析純化作為大規模質粒純化的主流技術，填料孔徑的選擇對質粒吸附性能影響顯著。企業需根據質粒特性，選擇合適的填料，以實現高效純化。

理想的產毒株細胞系應具備生長速度快、培養便捷、能高效支持 AAV 病毒復制和包裝的特點。此外，細胞系來源需可溯源，無外源因子污染，并且在規模化培養過程中保持傳代穩定性、遺傳穩定性和狀態穩定性。

目前，HEK293 細胞貼壁培養技術常用于實驗室小劑量病毒生產。而懸浮無血清細胞培養系統，如 HEK293、SF9 等細胞系的應用，極大地簡化了 AAV 生產的工藝放大流程，同時減輕了下游純化的負擔。

為保障細胞系在規模化培養中的穩定性，需定期進行細胞鑒定，采用 STR（短串聯重復序列）分型技術確保細胞身份的準確性，通過支原體檢測試劑盒杜絕支原體污染。

轉染效率低、質粒 DNA 和轉染試劑成本高，是 AAV 載體生產面臨的主要難題。

聚乙烯亞胺（PEI）是 AAV 規模化生產中應用廣泛的轉染試劑，雖價格低廉，但對細胞具有一定毒性，且對環境 pH 變化較為敏感。脂質體轉染效率相對較高，細胞毒性低，然而試劑費用高昂，在大規模生產中成本壓力較大。磷酸鈣轉染雖成本較低，但試劑純度和 pH 敏感性會導致 AAV 生產批次間差異顯著。

在三質粒轉染懸浮細胞培養系統中，質粒分配比例的失衡會降低轉染效率，進而導致空衣殼比率出現明顯的批次差異。構建衣殼基因序列及其它生產相關基因序列穩定整合的 AAV 包裝細胞系統，有望解決這一問題。

在生物制藥領域，實現 AAV 規模化生產，搭建穩定且易放大的生產體系是工藝開發的重點之一。在如今藥物開發競爭的大環境下，構建這樣一套生產體系，需以耗費大量的人力成本、時間和金錢成本為代價，無疑加重企業和研發人員的負擔。

為助力行業突破 AAV 規模化生產的重重難關，2025 年 4 月 17 日（周四）19：00 - 20 ：30，醫麥客攜手翌圣生物和行誠生物共同推出的主題為「從質粒到轉染：AAV規模化生產中的關鍵原料技術突破與合規性實戰經驗分享」的直播課。

屆時，翌圣生物研發總監滕以剛博士和行誠生物李軍輝博士將結合切身豐富的 AAV 生產項目經歷，深度剖析 AAV 規模化生產的質粒制備、轉染環節的技術要點，助力大家突破技術瓶頸。歡迎大家積極報名！

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