H5N1禽流感熒光定量PCR檢測試劑盒AFLP（amplified fragment length polymorphism）原理是一種結合 RFLP 和 PCR 技 術特點的、迄今為止zui有效分子標記分型技術，其原理如下： 本產品在傳統 AFLP-PCR 的基礎上經過精心優化而開發，
H5N1禽流感熒光定量PCR檢測試劑盒具有下列特點：
1. 一站式，足夠 50 次酶切-連接反應、50 次預擴反應和 1600 次 AFLP PCR（PCR 按 30 uL 體系計算），但不包括 DNA 純化和帶型分析試劑（如 PAGE 電泳試劑和 銀染試劑）。
2. 本系列產品提供 EcoRI-MseI 組合，適用于 GC 含量在 50%以上的基因組。對 GC 含量在 50%以下的基因組，需從本公司采購 AFLP（EcoRI-TaqI）組合。
3. 各種參數都經過優化，一次 PCR 所得 AFLP 片段數一般在 10-100 之間，可重復 性好，誤差小于 0.6%。4. 本產品適用于基因組在 500 Mb-6000 Mb 的材料（如動物和植物），對于基因組 在 50-500 Mb 的材料（如細菌和真菌）或 50Mb 以下的材料（如質粒，cosmid， BAC，YAC 和 PAC 等），需要分別另購專門的+1 型預擴引物混合液和+3 型 EcoRI 引物（8 種）AFLP 引物對。


運輸及保存 低溫運輸、-20℃保存, 有效期一年。
自備試劑 Southern 級 DNA 純化試劑，尿素-PAGE 電泳套裝，銀染試劑盒。
使用方法 一、 DNA 提取（本試劑盒不提供相關試劑）
用戶需要自備 50-500ng Southern 級別的基因組 DNA，用前zui預實驗以確保 DNA 能
夠被 EcoRI 和 MseI 內切酶*切開。
二、 限制性酶切和接頭連接反應（本試劑盒足夠 50 次本反應）
1. 在 0.2 mL 離心管中加入設置 20 uL 的限制性內切酶酶切體系：
成分 用量
酶切-連接 Buffer，10× 2 uL
樣品 DNA
50 ng（對小基因組材料）
500 ng（對大基因組材料）
如果用對照，則用 5uL
EcoR I-Mse I 酶混合液 2 uL
超純水 加水到 20 uL
2. 輕柔混勻并短暫離心后，37℃保溫 2 小時酶切（若 PCR 儀器不帶熱蓋，則必須加 50uL自備石蠟油，否則水分會蒸發影響反應。下同），70℃保溫 15 分鐘滅活內切酶。
3. 在上述酶反應體系中加入 20 uL EcoRI-MseI 接頭混合物和 1 uL T4 DNA 連接酶，輕柔混勻并短暫離心后，20℃保溫 2 小時讓接頭跟 DNA 段相連。
4. 在一個離心管中加入 10 uL 上步得到的連接反應液和 90uL TE 緩沖液，pH8，充分混勻，得到酶切-連接反應 10 倍稀釋液，未用完的酶切-連接反應原液（30uL）可放-20℃保存。
三、 預擴增（本試劑盒足夠 50 次本反應）
5. 在 0.2 mL 離心管中設置 30 uL 的 PCR 體系：
6. 離心數秒，按下列參數進行 PCR 預擴增：
溫度 時間
94℃ 30S
PCR（20 次） 56℃ 60S
72℃ 60S
7. 可以取 10 uL PCR 產物在 1.5%瓊脂糖膠上電泳檢測，產物為 100-1500 bp 模糊條帶。
8. 將剩下的預擴反應液用 TE 稀釋 50 倍，直接用于下步反應或放-20℃保存待用。
四、選擇性 PCR 擴增(本試劑盒足夠至少 1600 次本反應)
9. 在 0.2 mL PCR 管中，加入下列成分（如果用戶已經知道哪個一種或幾種引物組合適合自己的材料，則直接使用；如果不知道，則需要預先測試所有 64 種組合，設置 64 個 PCR反應），下面只是一種組合：
成分 體積
預擴反應液 50 倍稀釋液
10. 輕柔混勻后離心數秒，按下列參數進行 PCR：
溫度 時間
94℃ 30 秒
PCR（13 次） 65℃ 30 秒（每次循環遞減 0.7℃）
72℃ 60 秒
94℃ 30 秒
PCR（23 次） 55℃ 30 秒
72℃ 60 秒
延伸 72℃ 5 分鐘
五、尿素-PAGE 電泳和銀染
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