DNA快速連接試劑盒產品及特點
DNA 連接反應通過 T4 連接酶催化雙鏈 DNA 的 3'-OH 和 5'-P 形成磷酸二脂鍵而將DNA共價連接在一起。被連接的DNA末端可以是粘末端（例如限制性切割 EcoR I 產生的末端），也可以是平末端（限制性切割 Sma I產生的末端）。Pheiffer 等人發現 PEG 可以促進 T4 DNA 連接酶催化的
連接反應[NAR, 11, 7853-7871, 1983]，連接反應只需十分鐘即可完成。
本產品就是根據這一原理設計，

DNA快速連接試劑盒特點如下：
1. 超快，整個連接反應只需要室溫 5 分鐘左右，反應液可以直接用于轉
化實驗。
2. 高效，溶液配方經過優化，每 ug 插入 DNA 連接轉化得到的重組子可
達 107左右。
3. 既可用于平末端連接，也可用于粘末端連接，包括 PCR 產物與 T 載
體的連接。
4. 簡單，客戶只需要提供載體和插入片段即可。
規格及成分 成 份 編 號 30 次塑料袋包裝 100 次塑料袋包裝
溶液 A 70602A 150 uL 500 uL
溶液 B 70602B 30 uL 100 uL
使用手冊 70602sc 1 份 1 份

運輸及保存 低溫運輸，-20℃保存，有效期一年。
使用方法 一: 連接反應
1. 在無菌的離心管中嚴格按下表順序加入列各成分（以 10 uL 體系為
例）:
成分 陰性對照管 樣品管
溶液 A 5 uL 5 uL
插入片段（自備） - 0.2-0.5 ug(注)
載體（自備） 50 ng 50 ng
無菌水 補水到 9 uL 補水到 9 uL
注: 插入 DNA 片段的摩爾數zui是載體的 3-10 倍，如果載體長度
為 3000bp，則所需插入 DNA 片段折合成重量(ng) ＝ (插入 DNA
片段 bp 數×50 ng×N)÷3000 bp。N 就是自己選定的插入 DNA
片段與載體的摩爾比。
2. zui后在每管中加入 1 uL 溶液 B，輕柔吹打混合均勻后用微量離心機
將液體全部甩到管底。
3. 室溫放置至少 5 分鐘，zui長可以放置過夜。
4. 70℃保溫 10 分鐘。此步可以滅活有關的酶，否則轉化效率有所降低。
5. 根據使用的轉化方法，每管各取適量用于轉化實驗，余下的放置在
-20℃保存。
二：細菌轉化及篩選（僅供參考，本產品不提供相關試劑）
6. 將 100 μL 轉化效率在 1×108 cfu/µg 以上的感受態細胞于冰上解
凍。
7. 取 5-10 μL 連接產物加入到感受態細胞中，輕輕旋轉幾次以混勻。
8. 在冰上放置 30 分鐘。
9. 將離心管放 42℃熱休克 90 秒，然后快速將其轉移到冰浴中放置 1~2
分鐘。
10. 每管中加 900 μL LB 培養基，37℃振蕩培養 1 小時復蘇細胞。
11. 將 100 uL 復蘇涂布到含 Amp 的 LB 瓊脂平板上（根據載體情況也
可能需要加上 X-gal 和 IPTG）。
12. 室溫 4,000 rpm 離心剩余的 900 uL 復蘇細胞 5 分鐘，棄去 800 μ
L 上清，用剩余 100 μL 培養基重懸細胞并涂布到含 Amp 的 LB 瓊脂
平板上（可加 X-gal、IPTG）。
13. 將平板置于室溫直至液體被吸收。此步非常重要，否則培養板將在
37℃排除水分，細菌將隨水在培養基上到處游動，不能形成單個菌落。
14. 倒置平皿，于 37℃培養，12~16 小時后可出現菌落。一般情況下陽
性對照組會有上千個菌落（100 uL 轉化液產生的菌落數×10），自聯
對照只有少數幾個菌落，樣品組的菌落數取決于 PCR 回收片段的質
量。
15. 按常規方法篩選重組子。
技術資料
DNA 連接酶催化 DNA 連接的分子機制