NAD-蘋果酸脫氫酶（NAD-MDH）試劑盒說明書

微量法 100 管/96 樣

正式測定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定測定意義：

MDH （EC 1.1.1.37）廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，線粒體中MDH 是TCA 循環(huán)的關(guān)鍵酶之一，催化蘋果酸形成草酰乙酸；相反，胞漿中 MDH 催化草酰乙酸形成蘋果酸。草酰乙酸是重要的中間產(chǎn)物， 連接多條重要的代謝途徑。因此，MDH 在細(xì)胞多種生理活動(dòng)中扮演著重要的角色，包括線粒體的能量代謝、 蘋果酸-天冬氨酸穿梭系統(tǒng)、活性氧代謝和抗病性等。根據(jù)不同的輔酶特異性，MDH分為NAD-依賴的MDH 和NADP-依賴的MDH，細(xì)菌中通常只含有 NAD-MDH，在真核細(xì)胞中，NAD-MDH分布于細(xì)胞質(zhì)和線粒體中。

測定原理：

NAD-MDH 催化NADH 還原草酰乙酸生成蘋果酸，導(dǎo)致 340nm 處光吸收下降。

NAD-蘋果酸脫氫酶試劑盒   輔酶Ⅰ系列

組成：

自備儀器和用品：

紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96 孔板和蒸餾水。

樣本測定的準(zhǔn)備：

1、細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣品的制備：

細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴ 個(gè)）：試劑一體積（ml）為 1000~2000：1 的比例（建議 2000 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1ml 試劑一），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）；8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

組織：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(ml)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1ml 試劑一），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

2、血清（漿）樣品：直接檢測。

測定步驟：

1、分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 340nm，蒸餾水調(diào)零。

2、檢測工作液的配制：用時(shí)在試劑三中加入 19ml 試劑二和 0.5ml 蒸餾水，充分混勻待用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

3、測定前將檢測工作液在 37℃（哺乳動(dòng)物）或 25℃（其它物種）水浴 10min 以上。

4、在微量石英比色皿或 96 孔板中加入 5μl 樣本和 195μl 工作液，混勻后立即記錄 340nm 處 20s 時(shí)的吸光值A1 和 1min20s 后的吸光值A2，計(jì)算ΔA=A1-A2。

注意：若A1-A2 大于 0.5，需將樣本用提取液稀釋，使 A1-A2 小于 0.5，可提高檢測靈敏度。計(jì)算公式中乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)。

NAD-MDH 活力單位的計(jì)算：

a. 用微量石英比色皿測定的計(jì)算公式如下

1、血清（漿）NAD-MDH 活力的計(jì)算

單位的定義：每毫升血清（漿）每分鐘消耗 1 nmol 的NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。

NAD-MDH（nmol/min/ml）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷V 樣÷T=6430×ΔA 2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中 NAD-MDH 活力的計(jì)算:

（1） 按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位的定義：每mg 組織蛋白每分鐘消耗 1 nmol 的NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。

NAD-MDH（nmol/min/mg prot）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V 樣×Cpr) ÷T=6430×ΔA÷Cpr

（2） 按樣本鮮重計(jì)算：

單位的定義：每g 組織每分鐘消耗 1 nmol 的NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。

NAD-MDH（nmol/min/g 鮮重）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷（W× V 樣÷V 樣總）÷T =6430×ΔA÷W

（3） 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

單位的定義：每 1 萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘消耗 1 nmol 的NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。

NAD-MDH（nmol/min/10⁴ cell）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷（2000×V 樣÷V 樣總）÷T=3.215×ΔA

V 反總：反應(yīng)體系總體積，2×10^-4 L；ε：NADH 摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm； V 樣：加入樣本體積，0.005 ml；V 樣總：加入提取液體積，1 ml；T：反應(yīng)時(shí)間，1 min；W：樣本質(zhì)量， g；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；2000：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，2000 萬。

b. 用 96 孔板測定的計(jì)算公式如下

1、血清（漿）NAD-MDH 活力的計(jì)算

單位的定義：每毫升血清（漿）每分鐘消耗 1 nmol 的NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。

NAD-MDH（nmol/min/ml）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷V 樣÷T=12860×ΔA 2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中 NAD-MDH 活力的計(jì)算:

（1） 按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位的定義：每mg 組織蛋白每分鐘消耗 1 nmol 的NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。

NAD-MDH（nmol/min/mg prot）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V 樣×Cpr) ÷T=12860×ΔA÷Cpr

（2） 按樣本鮮重計(jì)算：

單位的定義：每g 組織中每分鐘消耗 1 nmol 的NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。

NAD-MDH（nmol/min/g 鮮重）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷（W× V 樣÷V 樣總）÷T =12860×ΔA÷W

（3） 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

單位的定義：每 1 萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘消耗 1 nmol 的NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。

NAD-MDH（nmol/min/10⁴ cell）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷（2000×V 樣÷V 樣總）÷T=6.43×ΔA

V 反總：反應(yīng)體系總體積，2×10^-4 L；ε：NADH 摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L / mol /cm；d：96 孔板光徑，0.5cm； V 樣：加入樣本體積，0.005 ml；V 樣總：加入提取液體積，1 ml；T：反應(yīng)時(shí)間，1 min；W：樣本質(zhì)量， g；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；2000：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，2000 萬。

NAD-蘋果酸脫氫酶試劑盒   輔酶Ⅰ系列