土壤堿性磷酸酶（soil alkaline phosphatase，S-AKP/ALP）活性測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)

分光光度法 50 管/48 樣

正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定測(cè)定意義：

土壤磷酸酶是一類(lèi)催化土壤有機(jī)磷化合物礦化的酶，其活性的高低直接影響著土壤中有機(jī)磷的分解轉(zhuǎn)化及其生物有效性，是評(píng)價(jià)土壤磷素生物轉(zhuǎn)化方向與強(qiáng)度的指標(biāo)。土壤磷酸酶受到土壤碳、氮含量、有效磷含量和pH 顯著影響。通常按照其最適 pH 范圍，分為堿性、中性和酸性三種類(lèi)型磷酸酶。

測(cè)定原理：

堿性環(huán)境中，S-AKP/ALP 催化磷酸苯二鈉水解生成ben酚和磷酸氫er鈉，通過(guò)測(cè)定酚的生成量即可計(jì)算出 S-AKP/ALP 活性。

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試劑組成和配制：

試劑二：粉劑×1 瓶，4℃保存。用前加 50ml 蒸餾水充分溶解。

試劑四：粉劑×1 瓶，4℃避光保存。臨用前加 1152μl 無(wú)水乙醇（自備），48 μl 蒸餾水充分溶解。（變褐色后不能再使用）。

標(biāo)準(zhǔn)品：液體×1 瓶，0.5μmol/ml 苯fen標(biāo)準(zhǔn)液，4℃保存。

具體產(chǎn)品的參數(shù)以收到產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)的參數(shù)為準(zhǔn)

自備儀器和用品：

可見(jiàn)分光光度計(jì)、臺(tái)式離心機(jī)、37℃恒溫培養(yǎng)箱、分析天平、可調(diào)式移液器、1ml 玻璃比色皿、冰、蒸餾水、無(wú)水乙醇和甲苯。

催化反應(yīng)：

稱(chēng)取風(fēng)干混勻土壤約 0.1g，加入 50μl 甲苯（自備），輕搖 15min；加 400μl 試劑一并且搖勻后，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱，開(kāi)始計(jì)時(shí)，催化反應(yīng) 24h；到時(shí)后迅速加入 1ml 試劑二充分混勻，以終止酶催化的反應(yīng)。

8000g，25℃離心 10min，取上清液置于冰上待測(cè)。

顯色反應(yīng)：

1. 分光光度計(jì)預(yù)熱 30 min，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到 660 nm，蒸餾水調(diào)零。

2. 空白管：取 1ml 玻璃比色皿，加入 50 μl 蒸餾水，100 μl 試劑三，20 μl 試劑四，充分混勻，顯色后再加蒸餾水 830 μl，混勻后 25℃靜置 30 min，于 660 nm 測(cè)定吸光度，記為A 空白管。

3. 標(biāo)準(zhǔn)管：取 1ml 玻璃比色皿，加入 50 μl 標(biāo)準(zhǔn)液，100 μl 試劑三，20 μl 試劑四，充分混勻，顯色后再加蒸餾水 830 μl，混勻后 25℃靜置 30 min，于 660 nm 測(cè)定吸光度，記為A 標(biāo)準(zhǔn)管。

4. 測(cè)定管：取 1ml 玻璃比色皿，加入 50 μl 上清液，100 μl 試劑三，20 μl 試劑四，充分混勻，顯色后再加蒸餾水 830 μl，混勻后 25℃靜置 30 min，于 660 nm 測(cè)定吸光度，記為A 測(cè)定管。

注意事項(xiàng)：

空白管和標(biāo)準(zhǔn)管只需測(cè)定一次。

S-ALP 活性計(jì)算公式：

活性單位定義：37℃中每克土壤每天釋放 1μmol 酚為 1 個(gè)酶活單位。

S-AKP/ALP（μmol/d/g 土樣）=[C 標(biāo)準(zhǔn)液×(A 測(cè)定管－A 空白管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管－A 空白管)]×V 總÷W÷T

= 0.725×(A 測(cè)定管－A 空白管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管－A 空白管)÷W

C 標(biāo)準(zhǔn)液：0.5μmol/ml；V 總：催化體系總體積，1.45ml；W：土壤樣品質(zhì)量，g；T：催化反應(yīng)時(shí)間，24 h=1 d。

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