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產品簡介：

非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(Native PAGE)是目前電泳法分離活性蛋白的主要方法之一，跟 SDS-PAGE 根據分子量大小分離蛋白質不同，它主要根據蛋白質的 pI 分離蛋白質。由于蛋白質的 pI 各不相同，所以對不同靶蛋白質需要選用具有不同 pH 的電泳體系。單獨配制不同 pH 的 Native PAGE 電泳膠十分繁瑣，為此本公司開發了本產品。

產品特點：

1.即開即用，用戶不需單獨準備各種成分，十分方便。

2.非變性，電泳過程中蛋白質保持天然的構象和亞基之間的相互作用，得到的蛋白質一般都具有生物活性（而 SDS-PAGE 得到的蛋白沒有活性）。

3.可以用于分析蛋白質和 DNA 或 RNA 的相互作用、蛋白修飾、蛋白構型改變、回收有活性蛋白質等試驗。

4.電泳后可直接用于考染、銀染、Western 雜交等實驗。

5.本產品足夠 30 次mini PAGE 電泳。

6.一站式蛋白質非變性PAGE電泳試劑盒（高pH）只能用于科研。

產品參數：

成份規格包裝

丙烯酰胺干粉60 g250 mL 棕塑瓶

甲叉雙丙烯酰胺干粉3 g5 mL 本色瓶

TEMEDCAS:110-18-91.5 mL1.5 mL 棕色管

過硫酸銨干粉CAS:7727-54-01 g1.5 mL 白蓋管

4×高 pH 濃縮膠配膠液pH 6.7100 mL125 mL 本色瓶

4×高 pH 分離膠配膠液pH 8.9200 mL250 mL 本色瓶

高 pH 電泳液pH 8.3（干粉）10 L500 mL 本色瓶

5×高 pH 上樣液1 mL1.5 mL 棕色管

使用手冊1 份1 份

運輸及保存

常溫運輸和保存，5×高 pH 上樣液需低溫運輸、-20℃保存，保存期為一年。

自備試劑

去離子水、天然 PAGE 蛋白質標準或蛋白質等電電泳標準品。

使用方法：

一：配制分離膠

1.確定濃度。對分子量在 100 kD 以上的蛋白質，可選用 3-5%的膠；對分子量在20-150 kD 之間的蛋白質，可選用 5-10%的膠；對分子量在 10-80 kD 之間的蛋白質，可選用 10-15%的膠。對未知樣品，建議使用 7.5%的膠。

2.配制 10%的APS（過硫酸銨）：按每 0.1 克過硫酸銨干粉加 1 mL 去離子水的比

例配制 10%的 APS 溶液，該溶液可以在 4℃存放一周。

3.配制 30%丙烯酰胺-甲叉雙丙烯酰胺（19：1）溶液:在本產品提供的裝有 60 克丙烯酰胺干粉的塑料瓶中加入 146 mL 自備的去離子水和 3 g 甲叉雙丙烯酰胺,充分搖晃直到溶解（約需 10-20 分鐘）即得 200 mL 30%丙烯酰胺（19：1）溶液。此溶液最好在一個月內用完，必須 4℃避光保存。

4.配 10 mL 分離膠(如果配制其他體積,請按比例調節各成分用量)：在一個 25 mL 的三角瓶中，先加入 4.2 mL 去離子水、3.3 mL 30%丙烯酰胺-甲叉雙丙烯酰胺（19： 1）溶液和 2.5 mL 4×分離膠配膠液。

5.搖晃混勻后抽真空 10-15 分鐘以去除溶液中的氧氣（氧氣能抑制丙烯酰胺聚合反應，不去除的話將影響丙烯酰胺聚合反應）。

6.加入 50 μL 新配制的 10%APS 和 10 μL TEMED（這是配制 10 mL 膠的用量，配制更大體積的膠則按比例增加），迅速搖勻后倒膠。

7.在膠面距離頂部 1-1.5 cm 的時候停止灌膠。然后覆蓋一層 1-5 mm 厚的水，使膠頂部液面平整。由于比重不同，水和丙烯酰胺溶液不會混合。

8.室溫聚合 30-60 分鐘后，用 1×分離膠配膠液洗滌凝固的膠的頂部，待用。

二：配制濃縮膠（濃縮膠可以提高分辨率，適合于成分復雜的樣品，一般使用濃度為4%。使用濃縮膠時蛋白質泳動速度主要跟其尺寸和形狀相關。因濃縮膠 pH 跟分離膠pH 不同，蛋白質可能會發生聚合和沉淀。對成分單一的樣品，可以不用濃縮膠，此時蛋白的泳動速度主要跟其電荷密度，尺寸和形狀相關。

9.配 10 mL 濃縮膠(如果配制其他體積,請按比例調節各成分用量): 在一個 25 mL 的三角瓶中，先加入 6.2 mL 去離子水、1.3 mL 30%丙烯酰胺-甲叉雙丙烯酰胺（19： 1）溶液和 2.5 mL 4×濃縮配膠液。

10.搖晃混勻后抽真空 10-15 分鐘以去除溶液中的氧氣（氧氣能抑制丙烯酰胺聚合反應，不去除將影響丙烯酰胺聚合反應）。

11.按上表用量加入 50 μL 10%APS 和 15 μL TEMED（這是配制 10 mL 膠的用量，配制更大體積的膠則用量需按比例增加），迅速搖勻后在已經凝固的分離膠上倒膠。

12.在液面達到頂部時停止灌膠，插入梳子。

13.室溫聚合 30-60 分鐘，拔出梳子，用 1×電泳液沖洗加樣孔。三：電泳

14.將凝膠板固定在電泳裝置上，往上槽和下槽加入足夠 1×電泳液。注：本產品提供

10 升電泳液，用前需將所有干粉溶解在 1 L 水中得 10×電泳液（注：需要 65℃ 加熱），可以室溫放置，用時再稀釋成 1×電泳液。一般不需要再調節 pH，但保險起見，可以用 pH 試紙測試一下 1×電泳液。高pH 電泳緩沖液的pH 是 8.3。

15.連接電極。如果濃縮膠和分離膠的 pH 高于靶蛋白pI，靶蛋白將帶負電荷并向陽極

移動，可以按標準的 SDS-PAGE 方法接通電極（上陰極下陽極）；如果濃縮膠和分離膠 pH 低于靶蛋白pI，靶蛋白將帶正電荷并向陰級移動，此時應該下陰極上陽極。

16.300 V 預電泳直到電流不再降低（約需要 30 分鐘）以去除殘留過硫酸銨。

17.換電泳液。

18.在液體蛋白質樣品中加入 5×上樣液（16 μL 液體樣品加 4μL 上樣液）后上樣。

0.75 mm 厚的膠可以上 10 μL，1.5 mm 厚的膠可以上 20 μL。在未用加樣孔中也要加 1×上樣液以防有樣品的空道的樣品擴散。注意：如果用考染檢測，每個孔的蛋白最好在 50-100 μg 總蛋白，如果銀染則只需要 1 μg 即可。樣品如果是蛋白質沉淀，可用 1×上樣液直接溶解蛋白質沉淀后再上樣。蛋白質溶液或沉淀中不能含有能夠改變上樣液 pH 的殘留成分（如蛋白質沉淀劑 TCA），用前最好用 pH 試紙測試一下，不在上樣液的 pH 范圍時就用酸或堿調到正常范圍。大量樣品可用透析法調 pH。

19.上樣自備的天然 PAGE 蛋白質標準或等電電泳的標準品（如果有的話）。

20.用 15 mA（對 0.75 mm 厚的膠）或 30 mM（對 1.5 mm 厚的膠）的電流電泳直

到染料移動到分離膠底部。微型膠一般需要 1-2 小時。注意：電泳過程最好在冷室或有冷卻系統，以免電泳產熱使蛋白質變性。

選擇我們的一站式蛋白質非變性PAGE電泳試劑盒（高pH），就是選擇精準、高效、可靠的檢測方案，為您的科研實驗保駕護航！